Гетерогенный это что в медицине
Гетерогенный это что в медицине
Гетерогенные процессы имеют важное значение в процессах жизнедеятельности организма и позволяют понять механизм формирования вещества костной ткани, действие кальциевого буфера, физико-химические основы развития таких заболеваний, как мочекаменная болезнь, рахит, подагра и др., а также обосновать ряд терапевтических мероприятий и диагностических методов исследования. Глубокое понимание закономерностей образования и растворения малорастворимых солей в организме человека необходимо будущему врачу.
В организме человека образование костной ткани это наиболее важный гетерогенный процесс с участием неорганических соединений. Основным минеральным компонентом костной ткани является гидроксофосфат кальция Ca5(PO4)3OH [1]. Наряду с кристаллическим гидроксофосфатом кальция в состав костной ткани входит аморфный фосфат кальция Са3(РО4)2, придающий гибкость костной ткани, содержание которого с возрастом уменьшается. Образованию Ca5(PO4)3OH способствует слабощелочная среда (рН≈8,3); в более кислой среде происходит процесс деминерализации. При образовании костной ткани зуба наряду с гидроксофосфатом кальция в эмали зуба образуется и фторидфосфат кальция Са5(РО4)3F, менее растворимое и механически более прочное соединение. Кроме того, повышенная концентрация ионов кальция в слюне (одноименный ион) приводит к его стабилизации. Причиной кариеса является растворение гидроксофосфата кальция под действием кислот, содержащихся в слюне. Поскольку Са5(РО4)3F более устойчив к действию кислот необходимо применять зубные пасты, содержащие ионы Са2+ и F–, стабилизирующие эмаль зуба.
Костная ткань взрослого человека находится в стационарном состоянии. Eжедневный обмен кальция в составе костной ткани составляет 0,7-0,8 г. Полная перестройка костной ткани осуществляется приблизительно каждые 10 лет. Поддержание в организме концентрации ионов кальция на постоянном уровне (2,25-2,75 ммоль/л) обеспечивают костная ткань и плазма крови. Эту систему нужно рассматривать как кальциевый буфер, функционирование которого регулируется гормонами. При понижении концентрации ионов кальция в крови активируется резорбция (рассасывание) костной ткани специальными клетками – остеокластами. При этом в межклеточном веществе образуются органические кислоты, в основном, молочная, способствующие растворению фосфатов кальция. При повышении концентрации ионов кальция уменьшается число остеокластов, угнетается резорбция костной ткани и активируется минерализация.
Механизм гетерогенных процессов лежит в основе и ряда патологических состояний. Кроме фосфатов ионы кальция в условиях организма образуют и другие малорастворимые соединения. Например, образование карбоната кальция СаСО3 является причиной атеросклеротического кальциноза. Развитию мочекаменной болезни способствует образование оксалата кальция СаС2О4, фосфата аммония магния NH4MgPO4, карбонатфосфата кальция Са10(РО4)6СО3·Н2О, мочевой кислоты и ее солей.
Костная ткань способна к изоморфному замещению ионов ее компонентов в узлах кристаллической решетки на другие компоненты. Явление изоморфизма может служить причиной ряда патологий. Так конкурентное замещение кальция на стронций, образующий менее растворимое соединение Sr5(PO4)3OH приводит к развитию стронциевого рахита, вызывающего хрупкость костей. Замещение кальция на бериллий вызывает беррилоз – размягчение костей.
Гетерогенные процессы используются и для коррекции некоторых патологических состояний. Например, реакции осаждения используют при отравлении щавелевой кислотой или ее солями, вводя в качестве антидота раствор СаCl2, при отравлении солями бария промывают желудок раствором MgSO4. Реакции растворения осадков применяют реже. Например, лечение подагры и мочекаменной болезни проводят солями лимонной кислоты, виннокаменной кислоты и ее солями, солями лития. Некоторые малорастворимые соединения используют в фармакотерапии. Их действие основано на совмещении гетерогенного и протолитического равновесий. Гидроксид алюминия, составляющий его основу, является антацидным средством. Растворение гидроксида алюминия прекращается при рН=4, что предотвращает полную нейтрализацию желудочного содержимого. При этом переваривающая активность уменьшается, но не прекращается. Нерастворившаяся часть Аl(ОН)3 оказывает обволакивающее и адсорбирующее действие.
Гетерогенный это что в медицине
Вашингтон, 6-10 апреля 2013
Основными темами, обсуждаемыми на конгрессе Американской Ассоциации по Изучению Рака (AACR), стали гетерогенность опухоли и теория клонов.
2 метастаза одной первичной опухоли. Один метастаз сохранил молекулярно-генетические признаки первичной опухоли и развивается из ее клеток (подклон «А»), второй метастаз – в том же органе – в силу генетических мутаций образован подклоном клеток «Б», соответствующих гистологически первичной опухоли, но отличающийся, например, мутацией PIK3CA. Дальнейшее развитие болезни: метастаз, образованный подклоном «А», остается без изменений в развитии и размерах; метастаз, образованный подклоном «Б», начинает метастазировать самостоятельно. В других органах появляются метастазы, отличные по молекулярно-генетическим признакам от первичной опухоли, соответствующие типу «Б», и, как правило, с более агрессивным течением. В определенный момент появляются подклоны «В», «Г» и т.п. – каждый со своим развитием и течением.
В описанном случае речь идет о внутриопухолевой гетерогенности. Внутриопухолевая гетерогенность также встречается в буквальном смысле внутри одной опухоли, т.е. внутри одного опухолевого очага: разные участки опухолевого очага образованы подклонами «А» и «Б».
Второй вариант – это межопухолевая гетерогенность. У каждого пациента с единым гистологическим вариантом, например, с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), существует свой клон. У пациента 1 – клон «1», у пациента 2 – клон «2». И, конечно, течение болезни разное. Это хорошо изучено на примере НМРЛ, с мутацией EGFR или без нее.
В теории – необходимо подавлять развитие каждого подклона, персонализировать терапию, влиять на каждую «мутацию», обеспечивающую выживание и деление клетки. Ведь уже известно из практики, что резистентность к терапии может быть вызвана устойчивостью определенного подклона (или даже одной клетки-предшественника подклона).
Схема лечения пациента в недалеком будущем может выглядеть так:
Об Американской Ассоциации по Изучению Рака (AACR)
Американская ассоциация, объединяющая специалистов, занимающихся фундаментальной онкологией и трансляционными исследованиями во всем мире. Ассоциация была создана в 1907 году 11 врачами, которых заинтересовал вопрос изучения рака. Сегодня AACR – это крупнейшее ведущее профессиональное сообщество. Например, 20% всех цитируемых в онкологии публикаций приходятся на журналы AACR, а в комитеты входят Нобелевские лауреаты, в том числе действующий директор Национального Института Рака (NCI). Ежегодный Конгресс AACR – «аналог» конгресса ASCO в фундаментальной онкологии.
ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ОПУХОЛИ — ДИНАМИЧНОЕ СОСТОЯНИЕ
Обобщены и проанализированы литературные данные по проблеме гетерогенности опухоли. Рассмотрены фенотипические проявления, генетические и эпигенетические механизмы развития, причинные факторы гетерогенности, а также ее значение для биологии популяций опухолевых клеток и чувствительности опухолей к терапевтическим воздействиям.
Гетерогенными называют предмет или систему, состоящие из множества варьирующих единиц/ компонентов, которые часто не легко сортируются или разделяются. Термин «гетерогенность опухоли» подразумевает существование ряда отличий клеток в опухоли, клеток первичной опухоли и метастазов, клеток отдельных метастазов одной опухоли [1]. В 1977 г. авторитетный журнал «Cancer Research» не принял к печати статью, авторы которой, получив и охарактеризовав 4 разные субпопуляции опухолевых клеток (ОК) из одной спонтанной опухоли молочной железы мыши, утверждали, что эти данные служат доказательством гетерогенности опухоли, и что такая гетерогенность является общим феноменом. Редакция отвергла статью, указав, что моноклональность опухолей — общеизвестный факт [2]. В настоящее время показано, что большинство опухолей обладает вариабельностью по широкому спектру морфологических и функциональных показателей. Установлено также, что гетерогенность (плейоморфизм) ОК затрагивает фенотипические, генетические и эпигенетические признаки. В процессе прогрессии опухоли составляющие ее клетки претерпевают ряд разнообразных изменений [2, 3]. В то же время остается открытым ряд фундаментальных вопросов относительно причин гетерогенности опухолей, механизмов ее формирования, значимости этого феномена для эволюции популяции ОК и развития опухолевого процесса. Гетерогенность ОК требует дальнейшего изучения и анализа и с позиций клинической онкологии — для совершенствования методов диагностики и лечения. Накопленный объем информации в этой области сегодня подобен котлу, в котором переплавляются несопоставимые понятия и созревают новые концепции.
Целью данной работы является обобщение и ана-
лиз данных о формах проявления, причинах и механизмах формирования гетерогенности ОК, а также точек зрения на проблему, идей и концепций с позиций оптимизации диагностики и лечения больных с опухолью.
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ОК: ФЕНОМЕНОЛОГИЯ, ВОЗМОЖНЫЕ ПРИЧИНЫ, БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Различают следующие формы гетерогенности опухолей: межопухолевая — разные (первично множественные) опухоли в одном органе могут иметь различный фенотип; внутриопухолевая — каждая отдельная опухоль состоит из фенотипически и функционально гетерогенных ОК с неодинаковым поведением [3]. Поскольку развитие первично множественных опухолей является достаточно редким феноменом, основной массив исследований по проблеме посвящен внутриопухолевой гетерогенности; в нашем обзоре мы также ограничимся рассмотрением только названного феномена.
Если каталогизировать выявленные в различных исследованиях параметры гетерогенности опухолей, становится очевидным, что выраженность последней зависит от этиологии опухоли, ее гистогенеза, локализации в органе. Неоднородность характерна как собственно ОК, так и компонентам (клеточным и неклеточным) опухолевого микроокружения; иными словами, гетерогенными могут быть и паренхима, и строма опухоли.
Согласно публикациям последних лет ОК одного новообразования могут отличаться как по морфологическим (степень дифференцировки, размеры, форма, количество ядер, цитохимические особенности, кариотип и т.д.), так и функциональным характеристикам (морфогенетические реакции, уровень пролиферации, взаимодействия клетка-клетка, подвижность, инвазивность, склонность к метастазированию, чувствительность к индукторам апоптоза, химиотерапевтическим агентам и иммунотерапии). Описана гетерогенность ОК по составу клеточных мембран; их антигенности; спектру маркеров клеточной поверхности, включая рецепторы ростовых факторов; по активности сигнальных путей, регулирующих пролиферацию, клеточный цикл, репарацию ДНК, апоптоз, функциональный ответ клеток на изменения условий внешней (внеклеточной) среды [2–4, 25].
Существенно варьируют не только параметры роста ОК in vitro, но и туморогенность in vivо (включая число введенных клеток, необходимое для генерирования опухолей; латентный период и скорость роста последних), чувствительность к неспецифическим реакциям противоопухолевого иммунитета и способность индуцировать специфический иммунный ответ хозяина. В свою очередь, изменение возраста и гормонального статуса организма хозяина оказывают влияние на отличия ОК [2, 3, 5, 6].
Гетерогенными являются и клональные популяции ОК. Показано, что при введении каждого клона ОК бестимусным мышам могут расти гистологически различные опухоли. Считают, что такая гетерогенность в значительной мере возникает вследствие фенотипической пластичности и различной дифференциации стволовых клеток опухоли под влиянием сигналов микроокружения и, вероятно, некоторых стохастических клеточно-автономных механизмов. Относительный вклад в гетерогенность наследственных и ненаследственных механизмов все еще не ясен [7].
Новообразования или их различные участки могут также отличаться по составу экстрацеллюлярного матрикса, клеточным и неклеточным компонентам соединительной ткани (стромы опухоли); по количеству и типам клеток иммунной системы, инфильтрирующих опухолевую паренхиму; по степени васкуляризации (как кровеносными, так и лимфатическими сосудами), по метаболическим особенностям микроокружения [67]. Иными словами, даже в одной опухоли ОК получают различные сигналы микроокружения, которые могут изменять фенотип когда-то идентичных клеток [9, 21].
В то же время показано, что наряду с фенотипическими отличиями, которые возникают в ответ на изменения условий внешней среды (микроокружения ОК), возможна гетерогенность ОК даже при наличии очевидно гомогенного окружения. Например, генетически гомогенные линии ОК могут проявлять морфологическую гетерогенность (сочетание округлых, не способных двигаться эпителиоидных клеток и подвижных фибробластоподобных клеток, которое можно обнаружить как in vitro, так и in vivo), которая является результатом различной взаимоисключающей и взаимообратимой активации G-белков Rac и Rho [8].
Вариабельность ОК разных первичных опухолей одного и того же органа, а также ОК в каждой отдельной опухоли не исчерпывают все аспекты опухолевой гетерогенности. Накапливается информация о фенотипических и генотипических отличиях между клетками первичных опухолей и метастазов, а также о гетерогенности метастатических опухолевых очагов. Однако данные достаточно разноречивы. Часть исследований, в которых сравнивали характеристики первичных опухолей и метастазов, обнаружили довольно тесную клональную связь. В частности, такая связь была выявлена для пер-
вичных и метастатических опухолей простаты (независимо от анатомической локализации метастазов), что подчеркивает природную моноклональность этих новообразований [10, 11]. В то же время другими исследователями при раке простаты обнаружена гетерогенность и в первичных опухолях, и в метастатических очагах [12, 13]. Выявлены радикальные отличия первичных и метастатических опухолей простаты, а также молочной железы, проявляющиеся в потере аллелей, что указывает на высокую степень генетической дивергенции [14, 15]. Сравнение последовательностей первичных лобулярных и метастатических опухолей молочной железы выявило множественные мутации, присущие только метастазам [16]. Считают, что первичная и метастатические опухоли могут развиваться как генетически отличающиеся в тех случаях, когда метастатическое распространение происходит на раннем этапе опухолевой прогрессии. Ясно, что необходимо дальнейшее изучение клональной связи между первичной и метастатическими популяциями ОК при злокачественных нововобразованиях различного гистогенеза.
Вопрос клональной гетерогенности внутри самого(их) метастаза(ов) еще менее изучен. Сложная сеть метастического микроокружения, комплексные взаимодействия ОК, клеток стромы, иммунных клеток, неклеточного матрикса и растворимых факторов являются ключевыми игроками прогрессии и метастазирования, а также гетерогенности метастатических опухолей. Повторим, что стромальные клетки как опухолей, так и метастазов коэволюционируют вместе с ОК, изменяя свой генои фенотип с целью аккомодации к нуждам своих постоянно меняющихся неопластических соседей [17]. Принимая во внимание приведенную информацию, актуальными представляются следующие вопросы: а) какова клональная связь между первичной и метастатической опухолями: являются ли клетки метастазов прямыми потомками клонов развитых первичных опухолей или они отклоняются на ранних стадиях эволюции опухоли?; б) какова степень гетерогенности метастатических опухолей по сравнению с первичными, являются ли они более или
менее клонально гетерогенными?
Существуют 2 основные концепции происхождения гетерогенности ОК: различные субтипы ОК возникают из различных стволовых клеток (концепция стволовой клетки); различные субтипы ОК возникают вследствие несовпадающих генетических и/ или эпигенетических изменений стволовой (мишеневой) клетки (концепция клональной эволюции) [9, 10]. Каждая из этих концепций исследуется немало времени. А. Marusyka, К. Polak [9] считают, что, хотя концепции стволовой клетки и клональной эволюции (фенотипической пластичности) имеют немало сходного, их следует взаимно исключить как фундаментально разные. Однако по мнению ряда исследователей, выявленные клеточные и молекулярные ме-
ханизмы не являются взаимоисключающими и могут действовать совместно. При формировании гетерогенности конкретных опухолей обе концепции (или каждая из них) могут быть в определенной степени справедливы. Даже если большинство ОК в некоторых (или многих?) опухолях не способны поддерживать пролиферацию и, таким образом, могут быть идентифицированы как нестволовые, компартмент стволовой клетки должен быть фенотипически различным и пластичным [21].
К сложным молекулярным и клеточным программам, определяющим характеристики гетерогенности и дифференциации (межклеточная адгезия, апикально-базальная полярность или ее отсутствие, отсутствие подвижности) эпителиальных клеток, а также приобретение ими мезенхимальных функций (подвижность, инвазивность, повышение резистентности к апоптозу), относится эпителиально-мезенхимальный переход. Последний детально проанализирован в обзорах [22—24], к которым мы отсылаем заинтересованного читателя.
Следует также упомянуть, что постепенно накапливается информация о синхронном изменении in vivo некоторых гетерогенных характеристик ОК, имеющих совершенно разную молекулярную основу, и о совпадении спектра таких характеристик при противоопухолевых воздействиях разной природы. Так, злокачественному (особенно метастатическому) фенотипу клеток многих опухолей присущи одновременно несколько признаков, определяющих резистентность ОК к цитотоксическому действию эффекторов естественного иммунитета. Это секре-
ция простагландина Е 2 (приводит к подавлению активности естественных киллеров, Т-лимфоцитов, нейтрофилов) и активация механизмов катаболизма Н 2 О 2 /супероксидных радикалов, в частности, каталаз и окислительно-восстановительного цикла глютатиона (обеспечивает защиту против продуктов
«кислородного взрыва» макрофагов, нейтрофилов) [71]. В то же время высокая активность системы глютатиона относится к числу признаков, гетерогенно экспрессируемых в популяции ОК в процессе формирования лекарственной резистентности, в частности, к алкилирующим соединениям или цисплатину [72]. Рассмотренные примеры иллюстрируют положение о том, что гетерогенность ОК является отражением их естественного отбора по множеству связанных с выживаемостью in vivo свойств. Приобретаемая в условиях организма устойчивость ОК к его защитным реакциям, относительная устойчивость к гипоксии, резистентность к лучевой и лекарственной (включая таргетную) терапии связаны с разными механизмами, но как явления, обусловленные отбором, имеют общую биологическую природу. Гетерогенность опухоли — необходимое условие возможности такого отбора.
Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнений, что опухоли не являются статичными образованиями. Они начинаются из генетически нор-
мальной клетки и завершают формированием популяции, состоящей из триллионов ОК, которые сформировали множество клеточных фенотипов. Наличие многих интерактивных субпопуляций (как ОК, так и клеток микроокружения) составляют основу феномена «прогрессия, диссеминация и колонизация опухоли», когда в течение времени опухоль претерпевает гетерогенные изменения своих свойств. Очевидно, что знание характеристик отдельных клонов ОК недостаточно для прогнозирования поведения опухоли в целом [18]. Удивительно, что несмотря на выраженную гетерогенность опухолей, они часто остаются относительно стабильными в течение развития от локализованной формы до метастазов и даже до последней стадии болезни [19, 20].
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ОПУХОЛИ
Механизмы диверсификации ОК могут быть аналогичными (или идентичными) нормальной диверсификации в эмбриональном и постэмбриональном периодах развития организма. Как уже отмечалось выше, ряд исследователей полагает, что одной из базисных причин гетерогенности популяции ОК является высокая изменчивость. Последняя связана, по крайней мере, с 3 механизмами: с повышением частоты истинных генетических изменений, которые закрепляются в ряду клеточных поколений (генетическая/геномная нестабильность); со значительным увеличением вероятности возникновения ОК эпигенетических изменений, вследствие которых может происходить подавление экспрессии одних генов и/или усиление экспрессии других; с наличием стохастической вариабельности экспрессии гомологичных белков в отдельных генетически идентичных клетках при одинаковых условиях внешней среды (генетический шум Эловица [68]).
Генетическая нестабильность (ГН) состоит в основном из 2 типов нарушений: генных мутаций (мутационная нестабильность, связанная с изменениями в последовательности нуклеотидов ДНК) и перестроек хромосом (хромосомная нестабильность, возникающая из их ошибочных реаранжировок). Структура и число мутаций и изменений хромосом со временем меняется в ОК по сравнению с нормальными клетками [26]. В некоторых ОК человека были описаны и другие формы ГН, в частности микросателлитная нестабильность, которая характеризуется увеличением или уменьшением числа олигонуклеотидных повторов, имеющихся в микросателлитных последовательностях генома [27, 28], а также разновидность ГН, для которой характерно повышение частот пар оснований [29]. В ОК и нормальной ткани наблюдаются различия между микросателлитами одного и того же локуса. Дестабилизация микросателлитных локусов, по-видимому, не служит непосредственной причиной малигнизации, однако может быть чувствительным маркером мутатор-
ного фенотипа, проявлением ГН и одной из характеристик гетерогенности ОК.
ГН является характерной чертой практически всех ОК человека, но на какой стадии развития опухоли она возникает и какова ее молекулярная основа в каждом конкретном новообразовании — это вопросы, на которые мы только начинаем получать ответы. В основе возникновения ГН лежат 4 основных типа нарушений: уменьшение точности воспроизведения генетический информации — понижение точности репликации ДНК и сегрегации хромосом во время митоза; нарушение в системах репарации повреждений ДНК или ошибок ее репликации; ослабление контроля клеточного цикла — активации чекпойнтов, в результате чего клетка с поврежденной ДНК или хромосомными изменениями продолжает делиться и умножать аномальную популяцию; ослабление индукции апоптоза, вследствие чего клетки с генетическими нарушениями не элиминируются из популяции. Все описанные нарушения так или иначе связаны с мутациями и инактивацией функции антионкогенов — опухолевых супрессоров. В 1997 г.
K.W. Kinzler и B. Vogelstein сгруппировали эти гены в 2 класса: «смотрители —caretakers« и «стражи/сторожа — gatekeepers« [31]. Продукты генов-стражей функционируют в системе контроля, обеспечивающего запрет на пролиферацию клеток с различными (в том числе генетическими) нарушениями. Генысмотрители кодируют продукты, которые принимают участие в репарации ДНК, стабилизируя, таким образом, геном. Некоторые опухолевые супрессоры (р53, BRCA1, ATM, CHK2 и др.) выполняют обе функции [32]. При наличии мутации в гене-смотрителе имеется высокая вероятность мутации и в генестраже [33]. В 3–31% спорадических опухолей человека в генах-смотрителях встречаются одна или более мутаций. Достаточно большой разброс данных может быть связан с отличиями в методиках, использованных для идентификации мутаций [30].
В спорадических опухолях человека основной формой ГН является хромосомная неустойчивость; для многих наследственных опухолей характерны мутации, в частности в генах различных систем репарации ДНК (разрывов ДНК — BRCA1/2, неспаренных оснований — MSH2,3,6, MLH1, PMS1,2, эксцизионной — XP A-G). На сегодня приняты 2 гипотетические модели ГН. Первая из них — мутационная, которая утверждает, что ГН имеется уже при предопухолевых состояниях и побуждает развитие опухоли путем повышения уровня спонтанных мутаций. Упомянутая выше идентификация мутаций в генах репарации ДНК при наследственных формах рака обеспечивает сильную поддержку этой гипотезе. Согласно второй модели основную роль в развитии опухоли играет индуцированная онкогенами (RAS, BCR/ABL) стрессовая репликации ДНК [30]. Нарушение правильной сегрегации хромосом может происходить вследствие изменения числа и структуры центросом или центров организации ми-
кротрубочек. К таким изменениям приводит активация RAS и инактивация опухолевых супрессоров р53, АРС, BRCA1.
Процесс репликации ДНК по существу ставит клетку в ситуацию риска приобретения мутаций. Многие гены системы репарации ДНК и гены, кодирующие ферменты матричного синтеза нуклеиновых кислот, называют мутаторными генами (генами-мутаторами). Нарушения функционирования и координации экспрессии генов метаболизма нуклеотидов приводит к возникновению мутаторного фенотипа так же, как и нарушения функционирования систем рекомбинации, транскрипции, контроля структуры хроматина; ферментных систем, контролирующих сегрегацию хромосом и число копий индивидуальных генов; систем, участвующих в синтезе эндогенных мутагенов [34].
Таким образом, ГН связана в конечном счете с изменениями онкогенов и опухолевых супрессоров. Однако, как следует из работ, выполненных на широком спектре опухолей человека, не многие из них мутированы, делетированы и/или амплифицированы в спорадических новообразованиях с большой частотой [35–38]. К наиболее «универсальным» относятся супрессоры р53, INK4a, PTEN, Rb, гены CKI (ингибиторов циклин-зависимых киназ), онкогены RAS и EGFR (две формы рецептора эпидермального фактора роста) [39]. Эти данные поддерживают точку зрения, что незначительная популяция ОК может потенциально обеспечить рост всей опухолевой массы, активно поддерживая гетерогенность ОК внутри опухоли [4]. Определение взаимодействий между генетически разнородными ОК может послужить основой новых методов терапевтического вмешательства.
Геном человека динамичен: согласно расчетам в течение суток в каждой клетке может реализоваться более 20 000 повреждений ДНК и более 10 000 ошибок репликации. Число белков, которые участвует в репликативных процессах ДНК клетки человека, неизвестно. Исследования на дрожжах показали, что поддержание генетической стабильности обеспечивают более 100 генов [36]. Даже если в окружающей среде отсутствуют мутагены, мутации происходят спонтанно со скоростью примерно 10–6 мутаций на ген в течение клеточного цикла. На протяжении жизни человека каждый отдельный ген может претерпеть около 1010 различных мутаций. В результате мутации встречаются по всему геному, включая гены, которые поддерживают генетическую стабильность. С этой точки зрения, проблема злокачественных опухолей состоит не в том, почему они вообще возникают, а почему они, с одной стороны, возникают так редко, с другой — сохраняются как относительно стабильные популяции [34, 44].
Эпигенетическими (Эг) называют наследуемые изменения в экспрессии гена, которые не связаны с качественными изменениями в последовательностях ДНК [45, 46]. Геном эукариотов собран в хро-
матин-структурный комплекс. Изменения структуры этого комплекса, а также модификация хроматина нехроматиновыми белками может влиять на экспрессию отдельных генов, приводить к активации и/или ингибированию различных сигнальных и метаболических путей. Генетические и Эг механизмы сочетаются и взаимодействуют на всех стадиях развития опухоли. Эг аберрации, в противоположность генетическим мутациям, потенциально обратимы; возможно восстановить их нормальное состояние. Эг гетерогенность считают ключевым элементом в прогрессии опухоли, особенно в условиях, неблагоприятных для последней воздействий, так как она обеспечивают популяцию ОК необходимым для успешной селекции многообразием и устойчивостью. В частности, приобретенная лекарственная устойчивость ОК связана преимущественно с Эг механизмами. Поэтому регуляторы последних являются потенциальными мишенями для новых терапевтических соединений [47, 48].
Эг гетерогенность реализуется посредством 3 отдельных взаимоусиливающих механизмов: изменений метилирования ДНК; посттрансляционной модификации коровых гистонов; экспрессии РНК, не кодирующих белок (микро-РНК и малые интерферирующие РНК (миРНК)). Кроме прямого эффекта на ядерные процессы (такие как транскрипционная активность), метилирование ДНК и модификации гистонов играют также ключевую роль в регуляции структуры хроматина и экспрессии генетической информации [49, 50], в нормальном развитии и поддержании клеточного гомеостаза, устраняют активность повторных элементов ДНК, инактивируют Х-хромосому у женщин [51].
клетке может приводить к фенотипической гетерогенности по ряду признаков. В последние годы отмечают значительный прогресс в выяснении природы и роли механизмов, вовлеченных в гипометилирование ДНК при онкогенезе. В ОК содержание геномного метилцитозина снижается от 4% в нормальных тканях до 2–3%, однако это обнаружено не во всех опухолях. Точные геномные локализации гипометилирования остаются предметом исследований [52]. Хотя большинство публикаций сообщает, что гипометилирование встречается в повторных элементах, это не дает окончательного ответа на вопрос, на каком этапе оно возникает и какую роль играет в канцерогенезе, ведь имеются отличия между различными классами повторных элементов. Ряд исследователей полагают, что гипометилирование происходит на раннем этапе трансформации [53], другие связывают его с более поздними этапами развития опухоли. Гипометилирование повторных элементов может способствовать ГН, обеспечивая пластичность и преимущества роста ОК, и является потенциальной терапевтической мишенью [52].
Важный Эг механизм, который регулирует структуру хроматина и экспрессию генов — модификации гистонов. Основными классами энзимов, участвующими в этих реаранжировках, являются ферменты ремоделирования хроматина и гистоновые модификаторы. Наиболее охарактеризованы такие посттрансляционные ковалентные модификации гистонов, как ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, убиквитинирование, сумоилирование, биотинилирование и ADP-рибозилирование. Хотя взаимодействие между различными модификациями гистонов еще не определено, многие из них способствуют развитию различных форм рака человека («гистоновые онкомодификации») [54]. Например, ацетилтрансфераза гистонов Tip60 не воздействует прямо (подобно опухолевым супрессорам или онкогенам), а облегчает действия других белков в силу того, что является транскрипционным коактиватором [55, 56]. Было описано ее вовлечение в экспрессию ряда генов, регулируемых фактором транскрипции NF-ƙB [57]. Последний активируется многими агонистами (провоспалительные цитокины, T- и B-клеточные митогены, продукты жизнедеятельности и структурные компоненты бактерий, вирусные белки, двуспиральные РНК, белки теплового шока и др.), а также при физических и химических стрессах, включая действие ионизирующей радиации и химиотерапевтических препаратов [59, 60]. Активированные факторы семейства NF-ƙB регулируют транскрипцию более 400 генов, вовлеченных в иммунорегуляцию, воспаление, регуляцию пролиферации и апоптоза, рост и распространение опухолей (в частности и супресссорный ген метастазирования KAI1). Этот же фактор регулирует химиои радиорезистентность в различных ОК. Из приведенного перечня ясно, что вариабельность эффектов активации NF-ƙB, опосредуемая ацетилтрансферазой Tip60, может приводить
к фенотипической гетерогенности ОК по широкому спектру характеристик [61]. Ацетилирование/деацетилирование модулируют экспрессию генов, вовлеченных в прогрессию опухоли в процессе селективного отбора ОК. Например, гипоксия (один из факторов, вызывающих гетерогенность ОК) индуцирует экспрессию и активность гистоновой деацетилазы, которая в свою очередь регулирует экспрессию Е-кадгерина — супрессорного белка, контролирующего сигнальный путь β-катенин/Cdk/pRb. Потеря экспрессии Е-кадгерина нарушает процессы адгезии, вызывает эпителиальную инвазию, необходимую для первого этапа метастазирования [58]. Еще одним важным регулятором гетерогенности опухоли являются миРНК, которые играют важную роль в поддержании целостности генома, в делении клеток, поддержании и дифференциации стволовых клеток (в эмбриональный и постнатальный период), в канцерогенезе, миграции ОК и метастазировании. Этот список продолжает расти. На ряде объектов исследования показано, что опухоль часто уклоняется от регуляции, опосредованной миРНК; репрессия миРНК ассоциируется с нарастанием туморогенности ОК. Каждая миРНК может регулировать экспрессию большого числа таргетных генов. И наоборот, один ген может быть регулирован многими миРНК, что может привести к гетерогенности клеток. Поняв уровень регуляции при помощи миРНК, можно существенно углубить понимание биологии опухолей, в частности проблемы гетерогенности ОК. МиРНК могут быть перспективными ми-
шенями противоопухолевой терапии [66].
Учитывая, что эпигенетические механизмы находятся в центре многих проявлений фенотипической вариабельности, представляется вероятным, что понимание и манипулирование эпигеномом обещает многое в профилактике и лечении злокачественных опухолей [3].
Гетерогенность клеток возникает естественно и неизбежно также из «шумовых» процессов — стохастичности в экспрессии генов, следствием которой является продукция в генетически идентичных клетках различных уровней конкретных белков в каждый момент. Стохастичность в экспрессии генов обусловливает существенные вариации фенотипов в популяции. Большинство исследований этого феномена проводили в популяциях микроорганизмов, однако в 2006 г. при измерении уровня различных белков в генетически идентичных клетках человека отмечены отклонения значений в отдельных клетках на 15–30% от среднего. «Генетические шумы» запускают ряд полезных физиологических механизмов регуляции, клеточную дифференцировку, участвуют в передаче или блокировании биологических сигналов, координируя экспрессию большого набора генов благодаря неравномерности уровней синтеза соответствующих белков, вариабельности продолжительности их жизни и распространения в клетке [41, 42]. Идеальной методологией исследования
стохастической экспрессии генов является мониторирование продукции, деградации и функционального состояния отдельных биомолекул в реальном времени в живых клетках [43]. Методами математического (компьютерного) моделирования и экспериментальных наблюдений показано значение генетических «шумов» для гетерогенности/вариабельности фенотипов. Последняя определяет высокие эволюционные потенции популяции, высокий уровень приспособления к переменам условий среды (3-й тип популяций по В. Гранту) [70], что так характерно для популяции ОК.
Для возможно полного анализа молекулярных
событий, характеризующих явление гетерогенности ОК, упомянем также следующие. Описаны многочисленные пути генерирования ошибочных белков, которые не вовлечены в процессы пролиферации и апоптоза клеток, однако являются важными для нарушения «социального поведения» ОК и их селективного преимущества перед нормальными клетками. На уровне трансляции ошибки могут возникать из-за неправильного включения аминокислоты, пробуксовки (slippage) машины трансляции или отсутствия модификации тРНК, приводящего к ошибке чтения мРНК. Такие ошибки встречаются 1 раз на каждые 1000–10 000 транслированных кодонов и относятся к гетерогенным характеристикам ОК [40]. При опухолевой прогрессии возможно усиление гетерогенности ОК вследствие посттрансляционных нарушений (процессинга предшественников, презентации и локализации) белков, значимых для сохранения и умножения опухолевой популяции. Примером может служить давно описанное, наблюдаемое с разной частотой в разных ОК, снижение экспрессии на клеточной мембране антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса, следствием чего является «невидимость» таких ОК для распознавания эффекторами специфического клеточного иммунитета [69]. Приспособление опухолей к особенностям обмена веществ в макроорганизме может достигаться репрограммированием метаболических путей ОК. Экспрессия некоторых генов, которые контролируют ключевые метаболические пути (гликолиз, липогенез и синтез нуклеотидов) радикально изменяется на различных стадиях прогрессии опухоли. Сегодня особое значение придают 3 группам генов: GLUT1, G6PD, TKTL1 и PGI/AMF (гликолиз); ACLY, ACC1 и FAS (липогенез); RRM2, p53R2 и TYMS (нуклеотидный синтез), — изменение которых также может вносить важный вклад в рост гетерогенности популяции ОК [62].
Таким образом, фенотип клеток (в том числе и ОК) в конечном счете определяется сочетанием генетической программы, воздействия внешней среды и случайными изменениями [3]. Популяции ОК обладают генетической, эпигенетической и фенотипической гетерогенностью, качественные и ко-
личественные параметры которой могут динамично изменяться в течение неопластического процесса, обеспечивая более агрессивное, метастатическое поведение опухоли. Гетерогенность является принципиально важным элементом в прогрессии опухоли, ее резистентности к «враждебному окружению» и разнообразным противоопухолевым воздействиям (химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии) [63–65], ибо она придает популяции ОК многообразие, устойчивость, возможность селекции.
Гетерогенность опухоли — это активное динамичное состояние, поддерживаемое как клеточными, так и неклеточными факторами. Новые варианты клеток, взаимодействуя между собой, помогают опухоли противостоять деструктивным влияниям. Как любое сообщество, опухоль не просто сумма слагающих ее субпопуляций, это взаимодействующая экосистема, каждая характеристика которой может влиять на другую. Биологические характеристики «ранней» преинвазивной опухоли не аналогичны таковым той же опухоли, когда она достигла стадии диссеминации. Гетерогенность опухоли имеет много уровней и молекулярных механизмов (еще не до конца раскрытых). Все они вместе обеспечивают выживание и распространение (диссеминацию, колонизацию, метастазирование) популяции ОК. Каждая ОК в организме больного уникальна по потенциальной возможности претерпеть различные изменения, и одна ОК, избежавшая действия терапии, может потенциально вызвать прогрессирование болезни.
Проблема клональной гетерогенности остается еще плохо изученной. Нужны новые подходы (включая математическое моделирование) для характеристики клональной гетерогенности различных типов и субтипов опухолей на разных стадиях их развития, а также в условиях различных лечебных воздействий. Тем не менее наши знания о гетерогенности ОК уже сегодня находят реализацию в диагностике и лечении онкологических больных. Например, на основе установления высокой гетерогенности по экспрессии HER2/neu клеток рака желудка и гастроэзофагеального рака разработаны принципы HER2-тестирования этих опухолей, отличающиеся от таких при раке молочной железы. Реализация этих принципов позволяет существенно повысить качество диагностики и выбирать оптимальную индивидуализированную тактику лечения пациентов с использованием таргетных (антиHER2/neu) препаратов [73]. Другим примером могут явиться разрабатываемые с учетом гетерогенности ОК и асинхронности их гибели при лечебных воздействиях рекомендации по оптимизации режимов исследования апоптоза ОК для оценки эффективности противоопухолевой терапии [74], в частности, больных раком молочной железы [75] или метастатическим раком почки [76].
Большинство данных о гетерогенности получены в результате исследований опухолей, клетки ко-
торых прошли отбор в условиях организма. Однако последние исследованя на уровне отдельной клетки показали, что в культуре клеток млекопитающих уже после нескольких делений появляется широкий спектр вариабельности в локальной плотности монослоя, в межклеточных контактах, относительной локализации и количестве свободного пространства на клетку, в форме и/или поляризации клеток, а также их подвижности. В сочетании эти параметры составляют популяционный контекст отдельной клетки, к которому каждая из них адаптирует свою физиологию. Такая адаптация может осуществляться на уровне транскрипции генов, трансляции отдельных белков, регуляции клеточного цикла, активности пролиферации, чувствительности к апоптозу, метаболических особенностей. Перечисленные характеристики определяют как поведение индивидуальной клетки в популяции, так и ее влияние на формообразование популяционного контекста. Эти комплексные и нелинейные механизмы обратной связи на многих уровнях клеточной организации определяют фенотипические свойства отдельной клетки в популяции, даже когда клетки не дифференцируются [25]. Все сказанное ставит проблему клеточной изменчивости и фенотипической гетерогенности не только в центр сегодняшней фундаментальной онкологии, но и современной биологии клетки.