Гетерозиготная форма мутации что это
Бомба замедленного действия: чем опасно носительство мутаций у будущих родителей
Когда тест на беременность показывает заветные две полоски – это очень радостное и волнительное событие. Будущие родители готовятся к тому, что с появлением малыша их жизнь заиграет новыми красками. К сожалению, не для всех пар эти мечты воплощаются в реальность. Иногда счастье сменяется болью утраты из-за того, что беременность прерывается по непонятным причинам.
Пары, пережившие такие события, часто начинают винить себя. Женщина перебирает в памяти события из своей жизни, пытается понять, что она делала неправильно, где совершила роковую ошибку, из-за которой всё это произошло. На самом деле чаще всего никто не виноват. Одна из возможных причин прерываний беременности и рождения детей с тяжелыми заболеваниями – наследственность. Генетические мутации коварны. Некоторые из них передаются по аутосомно-рецессивному типу. Катастрофа происходит, когда в клетках организма встречаются две «неправильные» копии гена. Оба родителя могут оказаться носителями. Каждый из них здоров, потому что один ген функционирует нормально. Но есть 25% вероятность, что ребенок получит оба дефектных гена. Это высокий риск.
Еще существуют наследственные заболевания, сцепленные с полом. Тут тоже довольно сложный механизм наследования. Например, если дефектный ген находится в «женской» X-хромосоме, то носительницами могут быть только женщины, а их сыновья в 50% случаев рождаются больными, в остальных 50% случаев они здоровы и не являются носителями.
Проблема в том, что такие «неправильные» гены обычно сложно выявить. У носителей нет симптомов, и они не догадываются о рисках для потомства. Зачастую это вскрывается только после нескольких прервавшихся беременностей или рождения ребенка с тяжелым заболеванием.
Случаи из нашей практики
В 2019 году в Репробанк обратилась пара, у которой было несколько потерь беременности и безуспешных попыток ЭКО. Эти люди очень хотели завести ребенка, они прошли обследование, и после тщательного обследования врач-генетик заподозрил в паре носительство одного из генетических заболеваний, относящихся к группе митохондриальной патологии.
Генетический анализ показал, что оба партнера являются носителями мутации в гене SCO2. Эта мутация связана с тяжелым заболеванием – фатальной инфантильной митохондриальной миопатией. Эта патология вызвана нарушением функции митохондрий – «клеточных электростанций», она проявляется в виде почечной недостаточности, поражения сердечной мышцы (кардиомиопатии), выраженных дыхательных нарушений, снижения мышечного тонуса, слабости, повышенного уровня молочной кислоты в крови (лактат-ацидоз).
Другая пара обратилась к нам по поводу замершей беременности на девятом месяце. Это одно из самых страшных осложнений беременности, которого сильнее всего боятся будущие мамы. Развитие плода останавливается, и он погибает. В случае с данной парой генетический анализ показал, что оба родителя являются носителями мутации, связанной со спинальной мышечной атрофией (СМА). Это наследственное заболевание может передаваться в том числе по аутосомно-рецессивному типу и характеризуется гибелью нервных клеток, ответственных за движения. Тяжелее всего протекает младенческий тип СМА: у таких детей с рождения нарушено дыхание, они не могут нормально сосать грудь, глотать, держать головку, сидеть.
Еще одна мутация, носители которой обращались в Репробанк, была связана с наследственным поликистозом почек. При этой патологии у детей примерно 90% ткани почек замещается кистами, развивается прогрессирующая почечная недостаточность. У этой пары в анамнезе было 4 потери ребенка.
Донорские половые клетки – одно из возможных решений
Для родителей, которые являются носителями одинаковых мутаций, связанных с тяжелыми наследственными заболеваниями, есть несколько решений. Вот что об этом говорит врач-генетик Александра Борисовна Тюрина:
«У партнеров, которые являются носителями мутаций в одном и том же гене, ответственном за редкую наследственную патологию, очень высок риск родить больного ребенка. Вариантов у таких семей несколько: сделать ЭКО с поиском семейной мутации у эмбриона, обследовать плод во время беременности, сделать выбор в пользу донорского материала, выбрать усыновление или отказ от деторождения вовсе. Это так называемые «reproductive options». Этот термин можно перевести как репродуктивный выбор или репродуктивные варианты. У каждого из этих вариантов есть как преимущества, так и недостатки, но нет плохого или хорошего решения. Каждая семья, столкнувшаяся с редким наследственным заболеванием, делает приемлемый для себя выбор. Репробанк помогает подобрать подходящего донора для каждой конкретной семьи и минимизировать риск рождения ребенка с наследственным заболеванием, если пара выберет этот путь».
Паре из нашего первого примера – носителям мутации SCO2 – было предложено воспользоваться донорскими половыми клетками. Для первой беременности наши специалисты оплодотворили яйцеклетку женщины донорской спермой, а для второй беременности сперматозоиды ее партнера использовали для оплодотворения донорской яйцеклетки. Оба донора были дополнительно проверены на носительство данной мутации. Теперь эта пара растит двух здоровых малышей.
«Наши стандарты отбора доноров – одни из самых строгих в мире. Донором Репробанка становится только 1 из 300 кандидатов. Мы стремимся снизить до минимума риски возникновения генетических заболеваний. В дополнение к необходимым, согласно №107н (803н) приказу, обследованиям все наши доноры обязательно проходят генетический скрининг. Многим из них проведено полноэкзомное секвенироване экзома — исследование (прочтение) всей кодирующей белок части генома.
Как итог, около 40% доноров мы отсеиваем по причине носительства того или иного частого или очень серьезного наследственного заболевания (а в некоторых случаях и нескольких одновременно). Для данной пары мы подобрали доноров спермы и яйцеклеток, не имеющих мутации в гене SCO2».
Автандил Чоговадзе, руководитель Репробанка.
Также мы могли бы предложить этой паре воспользоваться технологией предимплантационного генетического тестирования на моногенную патологию (ПГТ-М). Этот метод помог бы получить совместные эмбрионы у супругов, протестировать их и отобрать на перенос только те, что здоровы или являются здоровыми носителями. К сожалению, у этой технологии есть ряд ограничений: высокая себестоимость, значительное время для реализации. Поэтому наши пациенты отказались от этого варианта.
Все три наших примера иллюстрируют огромную роль генетических исследований при подготовке к беременности. Всем парам, планирующим завести ребенка, стоит проконсультироваться с клиническим генетиком вне зависимости от возраста, состояния здоровья и семейной истории. Это может помочь избежать трагедии в будущем.
Все доноры половых клеток в Репробанке проходят тщательное обследование, в том числе генетический скрининг. В нашем каталоге нет носителей опасных мутаций. Тем не менее, если вы решили использовать донорский материал, вам стоит пройти генетическое обследование.
Генетические нарушения у человека и методы их выявления
Генами называются участки ДНК, в которых закодирована структура всех белков в теле человека или любого другого живого организма. В биологии действует правило: «один ген – один белок», то есть в каждом гене содержится информация только об одном определенном белке.
В 1990 году большая группа ученых из разных стран начала проект под названием «Геном человека». Он завершился в 2003 году и помог установить, что человеческий геном содержит 20–25 тысяч генов. Каждый ген представлен двумя копиями, которые кодируют один и тот же белок, но могут немного различаться. Большинство генов одинаковые у всех людей – различается всего 1%.
ДНК находится в клетке внутри ядра. Она особым образом организована в виде хромосом – эти нитеподобные структуры можно рассмотреть в микроскоп с достаточно большим увеличением. Внутри хромосомы ДНК намотана на белки – гистоны. Когда гены неактивны, они расположены очень компактно, а во время считывания генетического материала молекула ДНК расплетается.
В клетках человека есть структуры, которые называются митохондриями. Они выполняют роль «электростанций» и отвечают за дыхание. Это единственные клеточные органеллы, у которых есть собственная ДНК. И в ней тоже могут возникать нарушения. 
Весь набор хромосом в клетке называется кариотипом. В норме у человека он представлен 23 парами хромосом, всего их 46. Выделяют два вида хромосом:
Методы исследования хромосом
Для исследования кариотипа применяют специальный метод – световую микроскопию дифференциально окрашенных метафазных хромосом культивированных лимфоцитов периферической крови.
Этот анализ применяется для диагностики различных хромосомных заболеваний. Он позволяет выявлять такие нарушения, как:
Однако с помощью исследования кариотипа можно выявить не все генетические нарушения. Оно не способно обнаружить такие изменения, как:
Для получения дополнительной информации, не видимой в световой микроскоп, используют хромосомный микроматричный анализ (ХМА). С его помощью можно изучить все клинически значимые участки генома и выявить изменения в количестве и структуре хромосом, а именно микрополомки (микроделеции и микродупликации).
Во время хромосомного микроматричного анализа применяют технологию полногеномной амплификации и гибридизации фрагментов опытной ДНК с олигонуклеотидами, нанесенными на микроматрицу. Если объяснять простыми словами, то сначала ДНК, которую необходимо изучить, копируют, чтобы увеличить ее количество, а затем смешивают ее со специальными ДНК-микрочипами, которые помогают выявлять различные нарушения.
Эта методика позволяет в одном исследовании выявлять делеции и дупликации участков ДНК по всему геному. Разрешающая способность стандартного ХМА от 100 000 пар нуклеотидов – «букв» генетического кода (в отдельных регионах от 10 000 п. н.).
С помощью ХМА можно выявлять:
Однако, как и предыдущий метод, хромосомный микроматричный анализ имеет некоторые ограничения. Он не позволяет выявлять или ограничен в выявлении таких аномалий, как:
Мутации в генах и заболевания, к которым они способны приводить
Мутации – это изменения, которые происходят в ДНК как случайным образом, так и под действием разных факторов, например химических веществ, ионизирующих излучений. Они могут затрагивать как отдельные «буквы» генетического кода, так и большие участки генома. Мутации происходят постоянно, и это основной двигатель эволюции. Чаще всего они бывают нейтральными, то есть ни на что не влияют, не приносят ни вреда, ни пользы. В редких случаях встречаются полезные мутации – они дают организму некоторые преимущества. Также встречаются вредные мутации – из-за них нарушается работа важных белков, наоборот, происходят достаточно часто. Генетические изменения, которые происходят более чем у 1% людей, называются полиморфизмами – это нормальная, естественная изменчивость ДНК Полиморфизмы ответственны за множество нормальных отличий между людьми, таких как цвет глаз, волос и группа крови.
Все внешние признаки и особенности работы организма, которые человек получает от родителей, передаются с помощью генов. Это важнейшее свойство всех живых организмов называется наследственностью. В зависимости от того, как проявляются гены в тех или иных признаках, их делят на две большие группы.
Например, карий цвет глаз у человека является доминантным. Поэтому у кареглазых родителей с высокой вероятностью родится кареглазый ребенок. Если у одного из родителей глаза карие, а у другого голубые, то вероятность рождения кареглазых детей в такой семье тоже высока. У двух голубоглазых родителей, скорее всего, все дети тоже будут голубоглазыми. А вот у кареглазых родителей может родиться ребенок с голубыми глазами, если у обоих есть рецессивные «гены голубоглазости», и они достанутся ребенку. Конечно, это упрощенная схема, потому что за цвет глаз отвечает не один, а несколько генов, но на практике эти законы наследования зачастую работают. Аналогичным образом потомству могут передаваться и наследственные заболевания. 
Как выявляют рецессивные мутации?
Для выявления мутаций, которые передаются рецессивно, используют целый ряд исследований.
Секвенирование по Сэнгеру – метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов, буквально – «прочтение» генетического кода) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Анализ используется для подтверждения выявленных мутаций. Это лучший метод для идентификации коротких тандемных повторов и секвенирования отдельных генов. Метод может обрабатывать только относительно короткие последовательности ДНК (до 300–1000 пар оснований) одновременно. Однако самым большим недостатком этого метода является большое количество времени, которое требуется для его проведения.
Если неизвестно, какую нужно выявить мутацию, то используют специальные панели.
Панель исследования — тестирование на наличие определенных мутаций, входящих в перечень конкретной панели исследования. Анализ позволяет выявить одномоментно разные мутации, которые могут приводить к генетическим заболеваниям. Анализ позволяет компоновать мутации в панели по частоте встречаемости (скрининговые панели, направленные на выявление носительства патологической мутации, часто встречаемой в данном регионе или в определенной замкнутой популяции) и по поражаемому органу или системе органов (панель «Патология соединительной ткани»). Но и у этого анализа есть ограничения. Анализ не позволяет выявить хромосомные аберрации, мозаицизм и мутации, не включенные в панель, митохондриальные заболевания, а также эпигенетические нарушения.
Не в каждой семье можно отследить все возможные рецессивные заболевания. Тогда на помощь приходит секвенирование экзома – тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК путем исследования в одном тесте практически всех областей генома, кодирующих белки, изменения которых являются причиной наследственных болезней.
Секвенирование следующего поколения-NGS – определение последовательности нуклеотидов в геномной ДНК или в совокупности информационных РНК (транскриптоме) путем амплификации (копирования) множества коротких участков генов. Это разнообразие генных фрагментов в итоге покрывает всю совокупность целевых генов или, при необходимости, весь геном.
Анализ позволяет выявить точечные мутации, вставки, делеции, инверсии и перестановки в экзоме. Анализ не позволяет выявить большие перестройки; мутации с изменением числа копий (CNV); мутации, вовлеченные в трехаллельное наследование; мутации митохондриального генома; эпигенетические эффекты; большие тринуклеотидные повторы; рецессивные мутации, связанные с Х-хромосомой, у женщин при заболеваниях, связанных с неравномерной Х-деактивацией, фенокопии и однородительские дисомии, и гены, имеющие близкие по структуре псевдогены, могут не распознаваться. 
Что делать, если в семье есть наследственное заболевание?
Существуют два способа выявить наследственные генетические мутации у эмбриона:
Предимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) в цикле ЭКО. Это диагностика генетических заболеваний у эмбриона человека перед имплантацией в слизистую оболочку матки, то есть до начала беременности. Обычно для анализа проводится биопсия одного бластомера (клетки зародыша) у эмбриона на стадии дробления (4–10 бластомеров). Существует несколько видов ПГТ: на хромосомные отклонения, на моногенные заболевания и на структурные хромосомные перестройки. Данные Simon с соавторами (2018) говорят о том, что в случае проведения ЭКО с ПГТ у пациентки 38–40 лет результативность ЭКО составляет 60%. Но при исследовании эмбриона есть ряд ограничений. Так, из-за ограниченного числа клеток можно не определить мозаицизм.
Если нет возможности провести ЭКО с ПГТ, то используют второй вариант – исследование плодного материала во время беременности.
Для забора плодного материала используют инвазивные методы:
Далее эти клетки исследуют при помощи одного или нескольких генетических тестов (которые имеют свои ограничения). Проведение инвазивных методов может быть связано с риском для беременности порядка 1%.
Таким образом, проведя дополнительные исследования, можно значительно снизить риск рождения ребенка с генетическим заболеванием в конкретной семье. Но привести этот риск к нулю на сегодняшний день, к сожалению, невозможно, так как любой генетический тест имеет ряд ограничений, что делает невозможным исключить абсолютно все генетические болезни.
Автор статьи
Пелина Ангелина Георгиевна
Ведёт генетическое обследование доноров Репробанка, осуществляет подбор доноров для пар, имеющих ранее рождённых детей с установленной генетической патологией.
Потеря гетерозиготности и онкогенез
Елена Воропаева, Татьяна Поспелова, Владимир Максимов, Михаил Воевода
«Природа» №7, 2020
Об авторах
Елена Николаевна Воропаева — доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний НИИ терапии и профилактической медицины (НИИТПМ) Института цитологии и генетики СО РАН. Специалист в области молекулярно-генетических механизмов опухолевой прогрессии гемобластозов, ведет разработку доказательных основ персонализированной терапии злокачественных лимфом.
Татьяна Ивановна Поспелова — профессор, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой терапии, гематологии и трансфузиологии Новосибирского государственного медицинского университета Минздрава РФ. Занимается изучением проблем множественной лекарственной устойчивости у больных опухолевыми заболеваниями крови, оценкой влияния типов метаболизма на переносимость полихимиотерапии, разработкой вопросов реабилитации пациентов после химиолучевой терапии.
Владимир Николаевич Максимов — профессор, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний НИИТПМ. Научные интересы связаны с изучением молекулярно-генетических основ мультифакториальных и наследственных заболеваний.
Михаил Иванович Воевода — академик РАН, доктор медицинских наук, руководитель научного направления фундаментальных и клинических исследований НИИТПМ. Область научных интересов — молекулярно-эпидемиологическая характеристика разнообразия генофонда населения Северной и Центральной Азии, эволюция генофондов древних и современных этнических групп Северной Азии, разработка методов молекулярно-генетического анализа вариабельности генома человека.
Многим известна детская книга А. С. Некрасова «Приключения капитана Врунгеля», в которой он рассказывает о кругосветном путешествии главных героев на двухместной парусной яхте «ПОБЕДА». В результате аварии на старте были сбиты две первые буквы названия судна, в результате чего оно стало именоваться «БЕДА». Обнаружив это, доблестный капитан воскликнул: «Скандал! Непоправимый скандал!». Он предчувствовал, что такое изменение в названии яхты может напрямую отразиться на судьбе корабля. К счастью, главные герои книги удачно завершили свое полное опасных приключений путешествие, однако так бывает не всегда.
Утрата части генетической информации — трагическое событие в жизни эукариотической клетки. Степень его опасности зависит от того, на какой стадии индивидуального развития организма (онтогенеза) оно произошло, а также генного состава и размера утраченного участка. Так, потери (делеции) участка хромосомы в период развития эмбриона становятся причиной его гибели либо приводят к рождению детей с наследственными синдромами нарушения развития, а при моносомии, т.е. при отсутствии целой хромосомы, эмбрион и вовсе не может начать развиться. Позднее, на любом из последующих этапов онтогенеза, также может происходить утрата части генетической информации в отдельных клетках организма, которая сопровождается таким явлением, как потеря гетерозиготности.
Напомним, что в соматических клетках человека в норме содержится двойной набор хромосом, один из которых получен от матери, а второй — от отца. На каждой паре хромосом есть соответствующие парные участки, называемые аллелями. Если два аллеля одинаковые, организм гомозиготный, если разные — гетерозиготный.
Установлено, что наиболее распространенный тип вариабельности генома — однобуквенные замены (однонуклеотидные полиморфизмы), плотность, которых приблизительно 1 полиморфизм на 300 пар нуклеотидов (п.н.). Генетические различия между людьми составляют в среднем 1 нуклеотид из 1000 п.н. Если брать в расчет только кодирующие белок участки генов (всего около 1,5–2% генома), то каждый человек гетерозиготен минимум по 6–10 тыс. позиций [1].
Неспособность клетки поддерживать постоянство своего генома (генетическая нестабильность) приводит к изменениям на различных уровнях организации наследственного материала.
Важное проявление генетической нестабильности — потеря гетерозиготности, под которой понимают уменьшение изменчивости в участках генома, для которых исходно был характерен полиморфизм.
Продвигаясь по клеточному циклу, клетка проходит ряд контрольных точек, в каждой из которых проверяется постоянство генома. Так, цель контрольной точки перехода из пресинтетической фазы в синтетическую — не допустить к делению клетки с поврежденной ДНК. На выходе из синтетической фазы проверяется полнота удвоения (репликации) генетического материала. Еще одну проверку на полноту репликации и повреждения ДНК клетка проходит в контрольной точке входа в митоз. Наконец, оценка связи всех хромосом с веретеном деления происходит перед переходом в анафазу, что необходимо для обеспечения равномерного распределения генетического материала между двумя дочерними клетками. При обнаружении нарушений на любом из этих этапов клеточный цикл должен быть остановлен, а повреждения устранены. В случае же невозможности репарации повреждений в клетке запускается апоптоз.
Проявлениями генетической нестабильности в опухоли могут быть утрата / добавление целых хромосом (анэуплоидия), а также потеря (делеция), преумножение (амплификация) или перенос (транслокация) отдельных хромосомных участков. Могут возникать нарушения в поддержании числа микросателлитных повторов (микросателлитная нестабильность), мутации отдельных нуклеотидов (вставки, делеции или замены), а также эпигенетические изменения (нарушение рисунка метилирования, модификация гистонов, спектра экспрессируемых микро-РНК и т.д.). Часть из этих нарушений служат причиной потери гетерозитности [2].
На рис. 1 представлен круговой график комплекса соматических нарушений, выявленных в геноме единичной меланомной (рак кожи) клетки, свидетельствующий о том, что в результате генетической нестабильности в опухоли не только происходит накопление тысяч однонуклеотидных замен, сотен малых инсерций и делеций нуклеотидов, десятков внутрихромосомных и межхромосомных перестроек, но и наблюдается потеря гетерозиготности, затрагивающая различные участки генома вплоть до целых хромосом.
Рис. 1. Комплекс соматических нарушений, выявленных в геноме меланомной клетки: около 30 тыс. однонуклеотидных замен и тысячи малых инсерций / делеций нуклеотидов. Синим цветом показано изменение копийности хромосомных участков, зеленым — внутрихромосомные перестройки, сиреневым — межхромосомные перестройки, красным — потеря гетерозиготности [2]
Механизмы потери гетерозиготности
Анэуплоидия. В настоящее время известно несколько механизмов развития потери гетерозиготности. Один из них — утрата целой хромосомы, или моносомия (рис. 2) [3]. Она может возникнуть в результате нарушения расхождения сестринских хромосом в митозе, что приводит к формированию трисомной и моносомной дочерних клеток. Потеря целой хромосомы в митозе может произойти и в результате нарушения связи одной из сестринских хроматид с веретеном деления, что приводит к формированию нормальной и моносомной дочерних клеток. В последующем единственная оставшаяся из пары хромосома (материнского или отцовского происхождения) может удваиваться. Таким образом, происходит восстановление копийности генетического материала без исправления потери гетерозиготности: появляется клетка с двумя полностью идентичными хромосомами (с гомозиготной дисомией).
Рис. 2. Потеря гетерозиготности при анэуплоидии
Гомологичная рекомбинация. Потеря гетерозиготности может быть связана с двуцепочечными разрывами ДНК и тем, в какие фазы клеточного цикла, каким образом и насколько эффективно они были подвергнуты исправлению. Во время удвоения генетического материала двуцепочечные разрывы ДНК могут возникать в ломких сайтах хромосом — участках, имеющих ряд структурных особенностей (рис. 3) [4].
Рис. 3. Типы ломких сайтов хромосом, значимых в онкогенезе [4]
Известно, что репликация начинается с определенных участков — точек начала репликации (origin), средняя плотность расположения в геноме которых 1 точка на 50 тыс. п.н. Однако в областях частых ломких сайтов хромосом на протяжении нескольких мегабаз (миллионов пар оснований, Мб) отмечается низкая плотность точек начала репликации. Кроме того, нуклеотидная последовательность данных участков обогащена АТ-повторами, что во время репликации приводит к образованию вторичных структур ДНК, мешающих продвижению репликационной вилки. Располагаются частые ломкие сайты хромосом, как правило, в областях гетерохроматина, где репликация «запаздывает», поэтому еще их называют позднерепликативными. Частые ломкие сайты — нормальное свойство всех хромосом человека, но некоторые из них становятся «горячими точками» хромосомных перестроек при злокачественных новообразованиях.
Относительно недавно был описан другой тип ломких сайтов хромосом, имеющих значение в онкогенезе. Их назвали раннерепликативными. Для таких ломких сайтов характерны расположение в активно транскрибируемых областях генома, высокая плотность точек начала репликации и обогащение последовательности GC-парами, затрудняющими продвижение репликационной вилки.
Застопоривание или остановка репликационной вилки (репликативный стресс) могут возникать не только в областях ломких сайтов хромосом, но и в местах появления однонитевых разрывов, поперечных сшивок, модифицированных оснований и других аномалий ДНК. В результате репликативного стресса к концу синтетической фазы не происходит полного удвоения генетического материала.
В норме ломкие сайты хромосом не проявляются, поскольку особый белок ATR-протеинкиназа, отслеживающий повреждения ДНК, при участии ряда других молекул в случае обнаружения «недорепликации» активирует остановку клеточного цикла в контрольной точке выхода из синтетической фазы. Далее белок Вернера (фермент, обладающий геликазной активностью) разрешает аномальные структуры ДНК, и процесс репликации в клетке возобновляется. Беда в том, что в опухолях могут возникать мутации в гене ATR и/или метилирование гена WRN, ответственного за синтез белка Вернера.
В синтетическую и постсинтетическую фазы клеточного цикла репарация двуцепочечных разрывов ДНК происходит путем гомологичной рекомбинации. Поскольку к этому моменту уже синтезированы копии молекулы ДНК, они используются в качестве матрицы для восстановления ДНК в месте повреждения. При этом активный 3′-конец оборванной нити встраивается в неповрежденный гомолог, на котором, как на матрице, проходит синтез недостающих участков нити ДНК. Вновь синтезированные участки затем сшиваются лигазой с основной частью молекулы ДНК.
Завершающий этап процесса гомологичной рекомбинации может осуществляться двумя принципиально различными способами — путем кроссинговера либо генной конверсии. Первый связан с разрешением соединения Холлидея, сопровождающимся образованием разрывов и в донорной и в реципиентной ДНК с последующим обменом соседними участками ДНК (кроссинговером). При репарации путем гомологичной рекомбинации по второму механизму разрывы в донорной ДНК не образуются, а идет инициированный свободным концом ДНК ограниченный синтез в районе повреждения. Затем вновь синтезированная нить вытесняется и отжигается со вторым свободным концом в реципиентном дуплексе. Таким образом, этот способ приведет к конверсии гена без хромосомных перестроек.
В случае репарации остановленных репликационных вилок механизм гомологичной рекомбинации отличается от классического, поскольку имеет место отсутствие части нуклеотидной последовательности и только один свободный конец ДНК. Процесс носит название рекомбинационно-зависимая репликация [5]. Начинается он также, как и при классической гомологичной рекомбинации, с поиска и проникновения свободного конца нити ДНК в двуцепочечную гомологичную последовательность. Двойная цепь, в которую происходит внедрение, расходится с формированием Д-петли, продвигающейся вниз по матрице при синтезе ДНК. Во время миграции вновь синтезированная цепь вытесняется. В последующем новая нить ДНК будет достроена до двуцепочечного состояния вплоть до конца хромосомы (рис. 4, а). Нетрудно догадаться, что данный вид репарации приводит к появлению наиболее протяженных областей потери гетерозиготности.
Рис. 4. Возможные механизмы рекомбинационно-зависимой репликации: а — миграция соединения Холлидея, синтез по матрице лидирующей цепи новой молекулы ДНК с последующим достраиванием ее до двуцепочечного состояния; б — синтез лидирующей цепи новой молекулы ДНК, использование нити расширяющейся Д-петли в качестве матрицы для синтеза отстающей цепи, разрешение соединения Холлидея с кроссинговером; в — миграция соединения Холлидея, синтез лидирующей и отстающей цепей с последующим их вытеснением [5]
Возможна не миграция, а расширение Д-петли и использование ее нити в качестве матрицы для синтеза отстающей цепи новой молекулы ДНК. Разрешение образующегося при этом соединения Холлидея приводит к кроссинговеру (рис. 4, б). Третий вариант протекания процесса рекомбинационно-зависимой репликации предполагает, что нить ДНК Д-петли также используется в качестве матрицы для синтеза отстающей цепи, но во время миграции Д-петли обе цепи (лидирующая и отстающая) вытесняются (рис. 4, в).
Таким образом, первый и третий вариант рекомбинационно-зависимой репликации приводят к митотической конверсии гена. При втором же варианте помимо переноса генетической информации, митотическая рекомбинация приводит к обмену участками между хромосомами.
При выборе последовательности, которая будет служить матрицей для репарации разрыва, большое значение имеет близость расположения реципиентной и донорной последовательностей друг к другу. При правильном протекании процесса гомологичной рекомбинации в качестве матрицы для восстановления ДНК в месте повреждения используется сестринская хроматида. Однако случается так, что матрицей становится гомологичная хромосома или другая близкая последовательность (например, гомологичный ген одного мультигенного семейства), что и приводит к потере гетерозиготности.
В случаях митотической конверсии гена неизбежно образование дочерних клеток, одна из которых будет иметь потерю гетерозиготности (рис. 5, а). Тогда как генотип дочерних клеток при митотической рекомбинации зависит от того, как в дальнейшем разойдутся хромосомы в митозе (рис. 5, б). Если две рекомбинантные хроматиды в метафазу окажутся друг напротив друга, то обе дочерние клетки будут иметь гетерозиготный генотип (так как рекомбинантные участки взаимно компенсируют друг друга). Если же напротив рекомбинантной хроматиды окажется нормальная, то результатом такого митоза будет потеря гетерозиготности: обе дочерние клетки будут гомозиготными по рекомбинантному локусу.
Рис. 5. Варианты расхождения хромосом в анафазе митоза при митотической рекомбинации (а) и митотической конверсии гена (б). ПГ — потеря гетерозиготности
Негомологичное соединение концов. Двуцепочечные разрывы ДНК приводят к нарушению целостности хромосом — одному из наиболее опасных для клетки повреждений. Они могут быть вызваны различными внешними неблагоприятными воздействиями на клетку, — например, ионизирующего или рентгеновского излучения, либо быть результатом нормальных внутриклеточных процессов. Недавно была предложена модель того, как может происходить повреждение ДНК на якорях петель хроматина. Во время транскрипции генов особый фермент топоизомераза TOP2B «садится» на якорь хроматиновой петли, чтобы ослабить деформацию кручения спирали ДНК путем внесения и последующего устранения двуцепочечного разрыва молекулы, но иногда ТОР2В не закрывает разрывы, приводя к онкогенной перестройке хромосом [6].
В фазы клеточного цикла, когда удвоение генетического материала еще не наступило, исправление двуцепочечных разрывов происходит путем негомологичного соединения концов. При этом ферментом лигазой напрямую «сшиваются» близлежащие поврежденные концы хромосом. Данный механизм репарации не всегда точен [7]. Есть вероятность того, что при возникновении нескольких двуцепочечных разрывов ДНК в пределах одной хромосомы произойдет негомологичное соединение лишь концевых фрагментов, что приведет к формированию клетки с потерей гетерозиготности в результате интерстициальной хромосомной делеции.
При появлении в клетке двуцепочечных разрывов ДНК в пределах нескольких хромосом, может произойти негомологичное соединение концов различных хромосом (хромосомная транслокация). В ряде случаев транслокация может носить несбалансированный характер, когда происходит не только изменение мест расположения генов на хромосомах, но и утрата части наследственного материала.
Еще один механизм формирования потери гетерозиготности — терминальная хромосомная делеция, т.е. отсутствие успешного восстановления одиночного двуцепочечного разрыва и потеря концевого фрагмента хромосомы.
В части случаев потеря гетерозиготности не только приводит к уменьшению изменчивости в участках генома, но и сопровождается изменением копийности генетического материала. Например, при утрате целой хромосомы или ее части в результате делеции или несбалансированной транслокации наблюдается гемизиготное состояние: в клетке остается только один аллель (материнского или отцовского происхождения).
Утрата хромосомы с последующей редупликацией, митотическая конверсия гена или рекомбинация приводят к гомозиготному состоянию: в клетке присутствуют два идентичных аллеля. Такая потеря гетерозиготности называется копий-нейтральной (рис. 6). При данном состоянии оба аллеля будут иметь происхождение от одного из родителей, что носит название приобретенная однородительская дисомия.
Рис. 6. Механизмы потери гетерозиготности: а — утрата целой хромосомы, б — концевая делеция плеча хромосомы, в — интерстициальная хромосомная делеция, г — несбалансированная транслокация, д — митотическая конверсия гена, е — митотическая рекомбинация, ж — утрата хромосомы с последующей редупликацией
О полной однородительской дисомии говорят, если копий-нейтральная потеря гетерозиготности затрагивает целую хромосому. Если же копий-нейтральная потеря гетерозиготности распространяется только на часть хромосомы протяженностью более 2 Мб, однородительская дисомия носит сегментарный характер. Исследования показывают, что при ряде злокачественных новообразований однородительская дисомия довольно распространенное явление [8].
Связь потери гетерозиготности с опухолевой прогрессией
Нестабильность генома лежит в основе опухолевой прогрессии — генетически закрепленного, наследуемого опухолевой клеткой и необратимого изменения одного или нескольких ее свойств. Важно понимать, что, однажды возникнув, генетическая нестабильность склонна прогрессировать: на первых этапах опухолевого роста медленно, а затем быстро нарастая. На тканевом, органном и организменном уровне это сопровождается увеличением степени злокачественности опухоли. Например, при эпителиальных новообразованиях наблюдается последовательный переход от различной выраженности гиперплазии через локализованную карциному (cancer in situ) к инвазивному и далее метастатическому раку.
Постоянная изменчивость свойств опухолей, с одной стороны, способствует их адаптации к недостатку кислорода и питательных веществ, ускользанию от иммунологического надзора и лечения, а с другой, делает их гетерогенными. При анализе клеточного состава опухоли было замечено, что со временем в ней формируется множество клонов, каждый из которых накапливает свои молекулярно-генетические нарушения, наделяющие их различной способностью к бесконтрольному делению, инвазии, метастазированию, устойчивости к меняющимся условиям существования и т.д.
Как правило, большая часть клеточного состава опухоли представлена наиболее «успешным» клоном злокачественно-трансформированных клеток, остальные субклоны — небольшой популяцией клеток каждый. С течением времени доминирующий клон может сменяться одним из субклонов, если в какой-то момент последний окажется более «приспособленным».
Несколько лет назад было опубликовано исследование, в котором с помощью однонуклеотидных микрочипов Affymetrix SNP Array были проанализированы геномы в двух группах образцов [9]. Первую группу составили 60 линий опухолевых клеток из коллекции Национального института рака (National Cancer Institute, NCI) США. Помимо клеточных линий эпителиальных злокачественных новообразований (рака кожи, почек, яичников, легких, кишечника, молочных желез, простаты), туда входили клеточные линии опухолей системы крови и головного мозга. В качестве группы сравнения были проанализированы образцы здоровых людей из международного проекта HapMap, а именно 30 семей «трио» (отец, мать и ребенок). Важно отметить, что и здоровые люди, и пациенты, от которых были получены линии опухолевых клеток, имели европейское происхождение.
По результатам исследования в образцах было зафиксировано наличие так называемых «rans of homozygosity» (ROH) — участков генома в диплоидном организме с протяженными (не менее 0,5–1 Мб) областями гомозиготности по однонуклеотидным полиморфизмам (таблица).
Таблица. Хромосомные районы, наиболее часто подвергающиеся потере гетерозиготности при злокачественных новообразованиях человека [9]
Протяженные области гомозиготности могут встречаться у здоровых людей, однако частота их в популяции низкая. Считается, что выявление протяженных областей гомозиготности в геноме здорового человека служит признаком низкой степени различий между отцовской и материнской хромосомами. Протяженные области гомозиготности в опухолевых образцах встречались с большой частотой (до 50–60%) и фиксировались в регионах генома, где расположены такие гены, как TP53, RB1, CDKN2B, TOB2, CLSPN и LATS2 (см. табл.). Стоит кратко остановиться на функции этих генов.
Первые пять участвуют в регуляции клеточного цикла. Так, ген ТР53 отвечает за синтез белка р53, имеющего широкий спектр онкосупрессорных функций. В частности, р53 является транскрипционным фактором, регулирующим не только клеточный цикл, но и процессы апоптоза и репарации ДНК. Другой ген CDKN2B кодирует белок MTS-2 (от англ. Multiple Tumor Suppressor 2 — множественный супрессор опухолей 2), который способен образовывать комплекс с циклинзависимыми киназами и ингибировать их активность. Большинство циклинзависимых киназ участвует в положительной регуляции деления, обеспечивая переход клетки из одной фазы клеточного цикла в следующую.
Белки, кодируемые генами RB1 и TOB2, обеспечивают контроль клеточного цикла в контрольной точке перехода пресинтетической фазы в синтетическую, а pRB еще и участвует в регуляции апоптоза и дифференцировки клеток.
Класпин (продукт гена CLSPN) селективно взаимодействует с хроматином в районе репликационных вилок и необходим для остановки клеточного цикла в контрольной точке выхода из синтетической фазы в ответ на репликативный стресс и повреждения ДНК.
Замыкает ряд ген LATS2. Он кодирует серин / треонин протеинкиназу, принадлежащую к семейству опухолевых супрессоров LATS (Large Tumor Suppressor). Данный белок локализуется в центросомах во время интерфазы и метафазы. LATS2 взаимодействует с другими белками центросом и необходим для накопления тубулина, из которого в начальные периоды митоза формируется веретено деления. Также данный белок функционирует в петле положительной обратной связи с белком р53.
Таким образом, полученные данные свидетельствует о том, что при опухолевой прогрессии самых различных злокачественных новообразований происходит отбор клеток, утрачивающих гетерозиготность в областях расположения онкосупрессорных генов, вовлеченных в регуляцию контрольных точек клеточного цикла, апоптоза и репарации ДНК. Почему же так происходит?
Злокачественная трансформация — сложный, многоступенчатый процесс, в основе которого лежат активация онкогенов, способствующих опухолевому росту, и/или выключение онкосупрессорных генов, препятствующих ему.
Протоонкогены кодируют участвующие в положительной регуляции клеточного цикла факторы роста и их рецепторы, протеинкиназы, передающие сигнал в ядро клетки, и транскрипционные факторы. Мутации в них, как правило, носят активирующий характер, приводя к трансформации протоонкогена в онкоген. Уже одного этого события может быть достаточно для трансформации нормальной клетки в опухолевую.
С онкосупрессорами, которые отвечают за негативную регуляцию клеточного цикла, апоптоз и репарацию ДНК, в основном ситуация обстоит иначе. Мутации в них приводят к снижению активности или выключению функции гена и чаще всего носят рецессивный характер. По этой причине в большинстве своем мутации в онкосупрессорах не будут иметь фенотипического проявления при сохранении второго нормального аллеля. Потеря гетерозиготности в гене онкосупрессоре, таким образом, приводит к переходу рецессивных мутаций в гомозиготное состояние и служит фактором позитивного отбора в опухоли.
Потеря гетерозиготности в гене ТР53 при лимфомах
Известно целое семейство генов транскрипционных факторов, которое включает в себя TP53, TP63 и TP73. Все они имеют высокую степень структурной гомологии, поскольку в процессе эволюции произошли от общего предка [10]. Считается, что у высших позвоночных белки p63 и p73 приняли на себя функции в онтогенетическом развитии тканей и органов, в то время как белок р53 стал хранителем постоянства генома клеток. Вместе с тем, показано, что р73 может активировать р53-чувствительные промоторы и индуцировать апоптоз в р53-дефицитных клетках.
Общее свойство большого числа злокачественных новообразований — потеря гетерозиготности в ТР53, который называют «дирижером ансамбля генов» противоопухолевой защиты организма. В опухолях с аберрациями в ТР53 отмечается особая выраженность генетической нестабильности и быстрые темпы поликлональной эволюции. Однако результирующее действие его аберраций во многом зависит от конкретного вида клеток, что может быть связано с особенностями экспрессии изоформ белка, определяющих различия в активности р53-регулируемых сигнальных путей в клетках разной тканевой принадлежности.
На протяжении многих десятилетий ТР53 считается одним из наиболее активно изучаемых генов. Тем не менее, и сегодня в нашем понимании механизмов его функционирования существует множество «белых пятен». Исходно меньшее внимание исследователей к ТР53 при опухолях кроветворной ткани привело к тому, что в литературе описаны единичные работы, где изучались бы варианты и последствия биаллельной инактиваций гена при лимфомах (опухоли лимфоидного ростка кроветворения).
Проведенные нами исследования ТР53 при одном из самых распространенных вариантов лимфом — диффузной В-крупноклеточной — выявили наличие большого числа сочетанных (мутации и/или потеря гетерозиготности и/или метилирование промотора) аберраций в гене, что свидетельствует об их приобретении и закреплении в ходе опухолевой прогрессии лимфомы, аналогично тому, как это происходит при эпителиальных злокачественных новообразованиях [11]. Однако в какой последовательности и на каких этапах преобразования нормальных В-лимфоцитов в опухолевые эти повреждения возникают, не всегда ясно.
Отличительная особенность ТР53 — необычный для онкосупрессоров спектр мутаций. Известно, что в генах-онкосупрессорах интенсивно происходит отбор мутаций, приводящих к потере синтеза полноразмерного белка (в результате нонсенс-замен или сдвига рамки считывания). Но более 80% наследуемых и соматических мутаций в TP53 — это миссенс-замены, которые сопровождаются синтезом стабильного мутантного белка, накапливающегося в ядре опухолевых клеток. Оказывается, большое число миссенс-мутаций в ТР53 приводит к приобретению белком р53 новых, не свойственных ему в норме и способствующих опухолевому росту функций, например, мутант-специфичной трансактивации онкогенов, а также ингибированию других белков семейства (р63 и р73). Поскольку функционирование р53 осуществляется в виде тетрамера, часть мутантных вариантов р53 имеют доминантно-негативный эффект, когда в результате олигомеризации с белком дикого типа нарушается работа всего комплекса.
Описанные факты объясняют, почему в части случаев при лимфомах единственной мутации ТР53 (в отсутствие изменений во втором аллеле гена) может быть достаточно для развития опухоли. С другой стороны, это не исключает возможности появления потери гетерозиготности позднее, в ходе поликлональной эволюции. Так, например, при лимфомах частота выявления потери гетерозиготности в гене возрастает с нарастанием стадии заболевания, а сочетание мутации и потери гетерозиготности в ТР53 способствует развитию синдрома Рихтера — трансформации медленно прогрессирующих вариантов опухоли в агрессивные.
Было установлено, что примерно в каждом десятом образце диффузной В-крупноклеточной лимфомы имеет место потеря гетерозиготности в гене ТР53 в отсутствие мутаций в кодирующих областях гена или метилирования в сохранившемся аллеле. Помимо того, что потеря гетерозиготности может быть «первым ударом», с развитием методов изучения генома, в том числе высокопроизводительного секвенирования, стали накапливаться другие данные, объясняющие это явление.
В ряде подобных образцов лимфомы нами были выявлены функционально значимые мутации в интронах и нетранслируемых областях гена. Так, в 3′-нетранслируемой области ТР53 была обнаружена наследуемая однонуклеотидная замена, которая разрушает нормальную последовательность сигнала полиаденилирования. Он необходим для добавления поли(А)-хвоста — нескольких сотен аденозинмонофосфатов — к концу незрелого мРНК-транскрипта. Отсутствие поли(А)-хвоста приводит к нарушению транспорта мРНК из ядра, ее стабильности и трансляции. И действительно, проведенные другими авторами эксперименты показали, что клетки лимфоидного ряда с этой однонуклеотидной заменой (в отсутствие других изменений в гене) характеризуются значительным снижением уровня экспрессии р53 и апоптоза под действием генотоксических факторов.
В здоровых тканях человека данная однонуклеотидная замена в 3′-нетранслируемой области ТР53 выявляется только в гетерозиготном состоянии. В то же время, более чем в половине случаев обнаружения ее в опухолевой ткани диффузной В-крупноклеточной лимфомы наблюдалась потеря гетерозиготности в гене, что должно способствовать приросту злокачественного потенциала опухолевых лимфоцитов.
Ранее подобное явление было описано при глиомах. Интегративный анализ данных Атласа генома рака (The Cancer Genome Atlas — TCGA) для глиомы показал, что у гетерозиготных носителей полиморфизма, разрушающего сигнал полиаденилирования гена ТР53, происходит утрата нормального аллеля во время инициации опухоли или ее прогрессии [12].
Имеются данные, согласно которым другой наследуемый однонуклеотидный полиморфизм, приводящий к замене в 72-м кодоне аргинина на пролин, при некоторых типах опухолей также может влиять на селекцию опухолевых клонов. Так, при сочетанных аберрациях в гене ТР53 мутации выявляются преимущественно в аргинин-содержащем аллеле, тогда как пролин-содержащий аллель подвергается делеции. Связывают это с тем, что мутантный р53 с аргинином в 72-м положении способен ингибировать белок р73 и нейтрализовать р73-индуцированный апоптоз [13]. Учитывая тот факт, что данное явление воспроизводится не при всех типах опухолей, требуется его отдельное изучение при лимфомах.
Безусловно, потеря гетерозиготности на большом протяжении короткого плеча 17-й хромосомы может затрагивать не только ТР53, но и другие гены. Так, рядом с ТР53 расположены два положительных регулятора его экспрессии — гены RPL26 и KDM6B/JMJD3. RPL26 особенно важен для увеличения стресс-индуцированного уровня p53, а KDM6B еще и модулирует функцию р53, влияя на внутриклеточное распределение белка. Считается, что в ряде случаев потери гетерозиготности в гене ТР53 дополнительная утрата одной из копий данных генов представляет собой еще один механизм снижения функциональной активности р53 в опухоли.
Когда-то Альберт Эйнштейн писал: «Наука не является и никогда не будет являться законченной книгой. Каждый важный успех приносит новые вопросы. Всякое развитие обнаруживает со временем все новые и более глубокие трудности» [14]. Все это в полной мере относится и к вопросу изучения потери гетерозиготности. Приведенные выше факты — показатели сложности и глубины связей между потерей гетерозиготности и развитием опухолей.