метод пцр на коронавирус что это такое как делают
Что такое ПЦР-тест на коронавирус
ПЦР-тест отличается высокой точностью, с его помощью в биологических материалах определяются разные чужеродные микробы. Например, бактерии, грибки, вирусы. Для проведения лабораторных исследований подойдут пробы слюны, мочи, сыворотки крови, разных жидкостей организма. Ведь именно в них присутствуют патогены. Для обработки образцов применяют химические реагенты. Они провоцируют выделение фрагментов геноме возбудителей. После количество нуклеиновых кислот увеличивается, это происходит благодаря воздействию слабых электродов, амплификации ферментом полимеразой. При увеличении их количества такие кислоты будет проще увидеть на специальном компьютерном оборудовании.
Для начала надо разобраться, что такое ПЦР-тест на коронавирус. ПЦР-тесты известны своей высокой чувствительностью, благодаря этому обеспечивается точный результат. Это актуально даже для тех ситуаций, когда в организме человека содержится немного инфекционных частиц и нет никакой симптоматики. Этот анализ делают, чтобы понять, болеет ли человек коронавирусом или нет. Но ПЦР-тест не может узнать стадию болезни, насколько давно был контакт с больным человеком. Это могут подсказать уже другие методы диагностики.
Особенности теста
Такой вирус, как SARS-CoV-2, проходит через рот, глаза, нос и таким образом достигает человеческого организма. С помощью специфичных шипов он цепляется клеток и фиксируется на мембранах. Чаще всего поражаются данным вирусом ткани систем пищеварения, мочевыделения, дыхания, ЦНС, также страдает сердце.
Как только человек заразился вирусом SARS-CoV-2, на протяжении первых нескольких дней он размножается непосредственно в эпителии носоглотки, причем делает это активно. Инфекция находиться в слюне, секрете, которое отделяется. Распространение инфекции между окружающими происходит во время глубокого дыхания, кашля, чихания больного человека. Последний может и сам не подозревать о болезни. Даже при отсутствии симптомов человек будет опасным и заразным. В большинстве случаев коронавирус напоминает стандартное ОРВИ, который не обладает какими-то особыми проявлениями. Чтобы определить, попал ли новый патоген в организм, стоит сделать ПЦР-тест.
Коронавирусы не циркулируют в лимфе, крови. Поэтому и анализ делают с носоглотки, ее слизистых оболочек. Медики утверждают, что у пациентов, у которых диагностируют манифестное либо бессимптомное течение болезни, есть вероятность, что результаты теста будут ложными. Возбудитель не будет долго оставаться на эпителии. Поэтому рекомендуется проводить анализ несколько раз. Если у человека долгое время не могут выявить коронавирус, можно сдать другой анализ – на антитела. Для этого используют метод ИФА.
Кто должен сделать тест?
Существуют определенные категории людей, которым очень нужно провести тест на коронавирус:
Вышеупомянутым группам людей должны делать анализы в рамках ОМС. Если другие люди захотят исследоваться и проверить, есть ли у них коронавирсу, то они могут выполнить нужный анализ, но он будет платным. Все тестовые системы, которые понадобятся для исследований, изготавливают в научно-исследовательских институтах, которые обладают специальной государственной лицензией.
Как правильно проводиться тест?
Важно подготовиться к тому, когда будут брать биоматериал для исследований. Иначе возрастает риск получить ложный результат. За сутки до анализа нельзя употреблять алкоголь и принимать антимикробные препараты.
Непосредственно перед самим анализом (за 2 часа) нельзя курить, чистить зубы, кушать леденцы, освежающие дыхание, пить воду, напитки, употреблять пищу. Также специалисты не рекомендуют пользоваться ингаляторами, назальными препаратами, полоскать рот или жевать жвачку.
Мазок берут из зева человека. При желании весь набор для диагностики курьер может доставить на дом больному, при этом все выполняется бесконтактно. Аппликатором, который расположен на конце стерильного тампона, проводят по слизистой. После материал кладут в герметичный пакет, после чего отправляют на исследование в лабораторию.
Возбудитель коронавируса относится к РНК-вирусам. Геном, который обнаруживают у человека, во время тестирования переводят в ДНК. А позже он обратно превращается в РНК.
Если говорить о полном цикле анализа, то результаты можно получить спустя 2-4 дня. Существует экспресс-диагностика, с результатами которой можно ознакомиться уже через 1 час. Однако такой тест будет иметь большую погрешность. Подобные данные считают предварительными, которые обязательно нужно повторно проверить.
Диагностика COVID-19: обзор основных методов
По мере изучения коронавируса появляются все новые методы его диагностики. На первых этапах заболевание выявляли лишь по набору симптомов, который со временем корректировался. Потом добавилась аппаратная диагностика: признаки поражения легких стали выявлять по компьютерной томограмме. Но биохимия и молекулярная биология не бездействовали. Постепенно медицина убедилась, что точный диагноз можно поставить только на основании результатов вирусологического исследования.
Сегодня узнать, заражен ли человек коронавирусной инфекцией, можно несколькими способами. О них и пойдет речь в этом материале. Мы разберемся, как выявить перенесенный ковид в прошлом и оценить устойчивость иммунитета к нему.
Лабораторные тесты на коронавирус (Covid-19)
Сегодня используются разные методы диагностики коронавирусной инфекции. Одни анализы можно сдать только в лаборатории, другие — самостоятельно (даже не придется вызывать врача на дом, достаточно купить специальные наборы в аптеке):
Первые четыре метода имеют идентичную задачу. Отличаются они сложностью проведения, затрачиваемым временем, точностью. Пятый их заменить не может.
Диагностика коронавируса (ПЦР)
ПЦР — это полимеразная цепная реакция. Она может делаться только в лабораторных условиях, поскольку требует изучения молекулярной структуры ДНК.
Суть процедуры сводится к следующему:
Если при копировании участка ДНК в нем продолжает появляться вирус, значит, пациент заражен. Получить результаты ПЦР-теста можно через несколько дней. Во время ожидания (особенно при наличии симптомов) лучше соблюдать самоизоляцию. Сегодня это наиболее достоверный диагностический метод.
Риск получения ошибочного результата
Вероятность получения ложноположительного результата невелика. Вирус может попасть в биоматериал пациента извне при условии нарушения санитарных правил. Поэтому проходить обследование лучше в надежных лабораториях, где подобное исключено.
Ложноотрицательные результаты встречаются чаще. Во избежание их получения перед забором биоматериала нельзя курить и дезинфицировать носоглотку антисептиками.
Исказить клиническую картину также могут:
Последнее возможно, если коронавируса там не было изначально (попал в организм иным путем, например, через кровь). Бывает, что в носоглотке возбудитель не оседает, а сразу продвигается в легкие и выявляется только на компьютерной томографии.
Экспресс-тест на коронавирус
Экспресс-тест можно сделать в домашних условиях. Он не предполагает лабораторных исследований, не требует специального оборудования. Достаточно купить набор в аптеке. Например, к Standard Q Covid-19 прилагается подробная инструкция.
Для проведения экспресс-теста на коронавирус понадобятся:
При наличии инфекции в организме контакт биоматериала с реактивом приводит к окрашиванию контрольной полоски. Результат появляется через 20-30 минут. Наибольшую точность тест показывает в первую неделю после заражения. В дальнейшем повышается вероятность получения ложноотрицательного результата. Для уточнения диагноза лучше сделать ПЦР-тест.
Анализ на антитела к коронавирусу
Анализ на антитела к коронавирусу показывает не присутствие инфекции в организме, а ответ иммунной системы на нее. В ответ на заражение она вырабатывает несколько типов иммуноглобулинов:
Недостаточно, чтобы антитела были просто выявлены. Нужно смотреть и на их комбинацию. Подчеркнем, что это исследование не направлено на выявление COVID-19 и не заменяет ПЦР-тест. Сдать такой анализ нужно, чтобы узнать, вырабатывает ли организм антитела к вирусу, а если да, то сколько.
Тесты на антитела
Разные виды тестов на антитела к коронавирусу проводятся дома или в лаборатории. В лаборатории берут кровь из вены и выполняют количественную оценку вырабатываемых иммуноглобулинов.
Домашний тест покажет, есть ли антитела в принципе. Сколько их вырабатывается, с его помощью узнать нельзя: для этого требуются познания в биохимии и специальное оборудование для подсчета. В этом случае достаточно капиллярной крови (из пальца).
В наборах, продающихся в аптеках (например, Leccurate SARS-CoV2 Antibody Test), есть специальный ланцет и пипетка для забора крови. Проколоть себе палец может не каждый, поэтому стоит прибегнуть к помощи близких или вызвать медсестру.
Анализ сдают натощак. Поесть можно максимум за 12 часов до забора крови. Диагностику следует отложить при повышении температуры.
Что показывает тест на антитела?
Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно. Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно. Иммунный ответ формируется до двух недель.
Результаты исследования на антитела в количественном выражении интерпретируют так:
Данное исследование не стоит воспринимать как пробу на коронавирус. Если антитела к нему есть, значит, контакт с возбудителем был. Но их отсутствие нельзя однозначно трактовать как избегание вируса.
Наличие антител и прививки
Положительный результат описанного исследования еще не гарантирует невозможность повторного заражения. Иммунитет формируется ориентировочно на полгода. Поэтому в регионах, где установлены ограничения, QR-коды выдаются не только привитым, но и переболевшим в течение последних шести месяцев. Однако присутствие иммуноглобулинов не отменяет необходимость вакцинации. Вопреки распространенному мифу, перед прививкой выяснять их количество не нужно.
Дополнительная диагностика
Перечисленные методы диагностики позволяют установить наличие в организме COVID-19 и иммунный ответ на него. Однако у разных людей заболевание протекает неодинаково: меняется набор симптомов, риски возникновения тех или иных осложнений.
Для подбора схемы лечения врач дополнительно может назначить:
Если у выздоровевшего пациента обнаружены антитела в достаточном количестве, это позволяет ему стать донором крови для лечения тяжелых больных. Для этого ему нужно пройти стандартную диагностику во избежание передачи иных вирусов реципиентам.
Коротко обо всех методах диагностики коронавируса
Мы рассмотрели возможные методы обнаружения коронавируса в организме, оценки его устойчивости к данному заболеванию. Подчеркнем, что наличие вируса и выявленные антитела к нему — не одно и то же, поэтому и показания к прохождению обследований отличаются.
При появлении первых признаков ОРВИ, которую легко перепутать с коронавирусом, лучше сразу выбрать полимеразную цепную реакцию. На этом этапе важно выяснить, имеет место банальная простуда или более опасное заболевание. Иммуноглобулинов на первых этапах вообще не бывает, так что искать их нет смысла.
Когда пациент выздоровел, можно оценить, как отреагировал его иммунитет на перенесенное заболевание. Поиск IgG оправдан и в случае, если пациент полагает, что перенес ковидную инфекцию бессимптомно.
Цепная реакция. Как работают тесты на коронавирус?
Как выглядят тесты на COVID-19, как они устроены, насколько точны и насколько доступны российским врачам? Об этом СПИД.ЦЕНТР поговорил с научной журналисткой, заместителем главного редактора портала PCR.news и профессиональным биологом Еленой Клещенко.
— Первый вопрос: а как вообще выглядит тест на коронавирус? Экспресс-тест на ВИЧ мы все видели: белая лопаточка с ручкой и пробирка с реагентом. Через 15 минут готов результат. Новый коронавирус тестируется по методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Насколько вообще его сложно производить?
— Выглядит тест на коронавирус как пробирки с прозрачными жидкостями в коробочке или пакетике, как-то так. Но чтобы провести саму реакцию и получить результат, нужно еще специальное оборудование.
Производить тест умеренно сложно, это высокие технологии, но очень хорошо отлаженные за много лет. Ограничения — как на любом производстве: реагенты и материалы, производственные мощности и должная культура производства — не надо объяснять, что будет, если чихнуть в пробирку, — плюс кадры. Каких объемов реально достигнуть — зависит от того, какие мощности будут задействованы: если, например, какие-то линии, которые сейчас производят ПЦР-тесты для других инфекционных заболеваний, волевым решением перебросить на SARS-CoV-2, производство возрастет.
— Почему сейчас тестируют коронавирус именно по методу ПЦР, а не иммуноферментного анализа, например, как ВИЧ? С ИФА диагностика была бы быстрее, дешевле? Или это вообще не имеет значения?
За подробностями лучше обратиться к специалистам в области молекулярной диагностики. Но, на мой взгляд, ПЦР с обратной транскрипцией, а именно он используется в случае с COVID-19, — хороший метод. Для ПЦР-тестов характерна высокая чувствительность. В их основе лежит амплификация нуклеиновой кислоты, то есть даже при малом количестве копий в образце можно получить хороший сигнал. Кроме того, для разработки таких тестов нужен, по большому счету, только геном вируса или часть генома.
— По факту ПЦР-тесты для COVID-19 появились почти сразу после того, как китайцы опубликовали расшифровку генома вируса. То есть для того, чтобы начать их разработку, не нужно было никаких образцов, хватило журнальной публикации и специалистов, способных быстро разработать технологию.
— Да. В том и прелесть ПЦР-теста, что для него достаточно генома вируса. Зимой, как только первый геном был опубликован, специалисты во всех странах начали заказывать синтез генетического материала nCoV-19. Зная нуклеотидную последовательность генома, в лаборатории можно получить участок этого генома и дальше экспериментировать уже с ним. В частности, проверить чувствительность и специфичность теста, используя вместо клинических образцов растворы ДНК.
В январе у ученых большинства стран вообще и не было другого выхода, настоящие пациенты имелись только в Китае. К такому методу могут быть претензии. Например, если чувствительность теста проверяется по растворам кДНК, не учитываются потери при обратной транскрипции. Тут разные другие тонкости. Но в целом ученые сработали очень оперативно.
КАК УСТРОЕН МЕТОД ПЦР?
ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом.
Он основан на многократном копировании (амплификации) определенных участков вирусной ДНК в лабораторных условиях. По факту, чтобы «засечь» вирус в организме, с помощью специального фермента, собирающего из нуклеотидов по образцу вирусной ДНК ее копию, ученые дублируют фрагменты генетического материала вируса, пока их число не станет настолько большим, что будет возможно зафиксировать его присутствие с помощью флуоресцентных меток.
Как это работает?
Сначала вирусную ДНК выделяют из материала, представленного в лабораторию, денатурируют: на этом этапе двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C, чтобы цепи ДНК разошлись. Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК.
Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На следующем этапе в смесь из ДНК, полимеразы и праймеров добавляются нуклеотиды — то есть строительный материал для воспроизводства, после чего емкость с нею нагревается до 37°C, и процесс запускается.
На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется (см. видео ниже).
В случае с вирусами, содержащими не «двойную» ДНК молекулу, а «одинарную» РНК (а это коронавирусы, или, например, ВИЧ), ученым приходится сначала провести обратную транскрипцию РНК с помощью фермента обратной транскриптазы, а уже потом производить амплификацию по той схеме, что была указана выше. Именно так, собственно, поступает и сам вирус, попадая в клетку, перед тем как встроить свою ДНК в человеческую и приступить к синтезу собственных белков, из которых состоит его «тело» (то есть не генетического материала, а самих вирусных частиц, при ПЦР же, наоборот, копируется генетический материал, а не новые частицы вируса).
Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х.
Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах (Thermal cycler).
Наглядно, как работает метод ПЦР, можно посмотреть на приведенном ниже видео.
— Что касается ИФА-тестов для коронавируса, их разработать так и не успели?
— Почему? Тесты на определение антител к антигенам SARS-CoV-2 в крови существуют. У теста на антитела свои преимущества. Но я бы сказала так: они с ПЦР-тестом дополняют друг друга. Тест на антитела лучше работает на поздних стадиях. Антитела в крови сохраняются и тогда, когда вирус исчезает из организма, то есть с помощью такого теста можно узнать, кто переболел COVID-19 в прошлом.
— Даже если у пациента не было выраженных симптомов и дело обошлось без госпитализации?
— А что за организации, кто в нашей стране занимается этими тестами? Роспотребнадзор?
— Роспотребнадзор — это очень обширная структура. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в нее входит, он и разработал тесты, которыми пользуются в лабораториях Роспотребнадзора. То есть производит тесты «Вектор», а проводят тестирование региональные центры Роспотребнадзора. Также на данный момент зарегистрирована тест-система от ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Минздрава России (ЦСП).
У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший.
О разработке своих тестов заявили и некоторые другие организации — Научно-исследовательский институт микробиологии Минобороны РФ совместно с компанией СИНТОЛ, НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздрава России (НИЦ им. Н. Ф. Гамалеи), компания «ДНК-технология». Производство собственных тест-систем планирует запустить Центр молекулярной диагностики CMD (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). И это хорошо, когда есть разные тест-системы, их можно сравнить, проверить результаты одной с помощью другой.
На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе. Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить.
— На 15 марта появилась информация, что в России было произведено почти 110 тысяч тестов на коронавирус. Это много для наших масштабов или мало?
— По поводу возможности произвести достаточное количество тестов — тут много вопросов: производственные мощности, которыми мы располагаем, количество реагентов, которые понадобятся, наконец, лаборатории с необходимой техникой и обученным персоналом, где эти тесты проводить. Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать.
— Российских тестов несколько. В чем их принципиальные отличия? Почему государство выбрало именно те, что сделали в «Векторе»?
— Пока в России зарегистрировано три теста — два от «Вектора» и один от ЦСП. У тест-системы ЦСП чувствительность указана выше, есть внутренний контроль — РНК, которую добавляют в образец. Если эта РНК исчезнет в процессе, не даст сигнала, значит, что-то пошло не так. Это знак, что могла исчезнуть и вирусная РНК, а стало быть, отрицательный результат следует считать ложноотрицательным. Про остальные тест-системы поговорим, когда они получат регистрационные удостоверения.
Почему государство выбрало именно «Вектор» для выполнения этого задания, мне неизвестно. Наверное, могли бы выбрать и, например, ЦНИИ эпидемиологии того же Роспотребнадзора. «Вектор» знаменит тем, что в нем работают с опасными патогенами, а «уханьский коронавирус» на тот момент выглядел очень пугающе: и по смертности среди заболевших, и по инфекционности были прямо страшные оценки. Может быть, в этом причина, может быть, в чем-то другом, это надо узнавать у тех, кто принимал решение.
О рекомендациях как подготовиться к сдаче ПЦР-теста на COVID-19
В условиях сохранения рисков распространения новой коронавирусной инфекции Роспотребнадзор напоминает, что при сдаче ПЦР-теста необходимо соблюдать определенные рекомендации.
Что будет, если есть или пить перед сдачей мазков для теста ПЦР?
По инструкции к наборам для ПЦР-исследования на SARS-CoV-2 взятие мазков рекомендуется проводить не раньше 3-4 часов после последнего приёма пищи. Почему это важно?
Коронавирус SARS-Cov-2 живет внутри эпителиальных клеток. Для ПЦР-исследования важно получить мазок с достаточным количеством инфицированных клеток. В момент проглатывания еды эпителиальные клетки механически слущиваются пищевым комком с поверхности слизистой оболочки. Если взять мазок сразу после еды, в пробирку может попасть недостаточное количество инфицированных клеток. В этом случае, пациент может получить ложноотрицательный результат анализа. То же самое касается питья. Вода смывает с поверхности миндалин, задней стенки глотки инфицированные клетки.
Можно ли пользоваться лекарственными средствами в нос и горло (капли, спреи, антисептики) перед сдачей мазков?
Перед взятием мазков ни в коем случае нельзя использовать лекарственные средства для местного применения (капли, спреи и др). После их применения количество вируса на слизистой снижается и увеличивается вероятность получения ложноотрицательных результатов ПЦР-теста.
Можно ли употреблять алкоголь перед сдачей теста ПЦР и как это повлияет на результат?
Алкоголь содержит этиловый спирт (этанол), который также входит в состав многих антисептических средств. По рекомендациям Роспотребнадзора, для эффективного антисептического действия в составе дезинфицирующего средства должно быть не менее 60-80% этилового спирта. Хотя в состав спиртных напитков (обычно) входит меньше этанола, чем необходимо для дезинфекции, но после приема алкоголя вероятность выявления коронавируса в мазке также может снизиться.
Почему нельзя чистить зубы перед сдачей теста ПЦР?
Основная цель на этапе взятия мазков для ПЦР-исследования – получить биологический материал с достаточным количеством клеток, пораженных коронавирусом. Применение любых очищающих средств для полости рта снижает количество вируса в получаемом мазке. Зубная паста может содержать антисептические компоненты. Попадание ее остатков в пробирку с мазком может мешать проведению анализа. Кроме того, чистка зубов требует еще и дополнительного полоскания рта, что также не рекомендовано перед забором биоматериала.
Применение косметики (помады, блески и бальзамы для губ) может повлиять на результат теста?
Материал для исследования берут не из полости рта, а из зева и носоглотки. Если соблюдать все правила взятия мазка и не прикасаться зондом к губам, то наличие декоративной косметики не должно помешать получению адекватного материала для ПЦР-теста. Но при случайном попадании в пробу косметические средства могут замедлить ПЦР-реакцию. Поэтому лучше декоративную косметику нанести уже после того, как мазок был взят.
Откуда все-таки берут мазок – из зева или носоглотки?
И из зева, и из носоглотки. Входными воротами для вируса SARS-CoV-2 являются верхние дыхательные пути. После попадания на слизистые носо- и ротоглотки (зева) вирус начинает размножаться в эпителиальных клетках. Поэтому в конце инкубационного периода и в первые дни клинических проявлений наиболее информативными являются мазки именно из этих областей. Для исследования мазок берут с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. При взятии мазка из носоглотки зонд вводят по наружной стенке носового хода на достаточную глубину. Мазок, взятый со слизистой преддверия носа, может не выявить РНК коронавируса SARS-CoV-2.
Минимум за 3 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) нельзя: принимать пищу, пить, чистить зубы, полоскать рот/горло, использовать спрей-освежитель для ротовой полости, жевать жевательную резинку, курить.
Минимум за 3 часа до взятия мазков из носоглотки нельзя: промывать нос, использовать спреи, капли, мази для носа.
За два дня до взятия мазка рекомендуется отказаться от употребления спиртных напитков.
