не обнаружено аллельных вариаций исследуемых локусов что значит
Микросателлитная нестабильность (MSI) – тест в израильской клинике за 1 день
В клинике Hadassah Moscow проводится быстрое молекулярно-генетическое тестирование микросателлитной стабильности опухоли (MSI) с возможным назначением иммунотерапии в тот же день у пациентов с метастазами вне зависимости от типа рака. Данное направление в онкологии является инновационным подходом персонализированной терапии.
Микросателлитная нестабильность — что это?
Опухолевые клетки активно делятся, что приводит к появлению нарушений в их геноме, в том числе появлению новых микросателлитных повторов. Если система репарации клетки не устраняет эти ошибки, такое состояние называется микросателлитной нестабильностью. Оценка микросателлитной нестабильности проводится с использованием теста полимеразной цепной реакции (ПЦР) или иммуногистохимического исследования.
Имеет ли оценка микросателлитной нестабильности клиническое значение?
В нескольких клинических исследованиях было показано, что у онкологических пациентов с микросателлитной нестабильностью такие иммунные препараты как пембролизумаб или ниволумаб продемонстрировали позитивные результаты. На этом основании регуляторные органы различных стран одобрили применение этих ингибиторов контрольных точек (пембролизумаб, ниволумаб) вне зависимости от типа опухоли у пациентов с микросателлитной нестабильностью. Кроме того, наличие или отсутствие этого маркера может иметь значение для назначения таргетной и адъювантной терапии, чему посвящены последние исследования.
Микросателлитная нестабильность не обнаружена — что это значит? Это означает, что опухоль стабильна (MSS) по нескольким мутациям, иммунотерапия может быть не показана. Однако, для определенной группы опухолей иммунотерапия назначается даже несмотря на результат MSS. Например, иммунотерапия используется у больных раком легкого с экспрессией другого маркера – PD-L1. То есть лечащий врач-онколог подходит к оценке всех молекулярно-генетических изменений комплексно и индивидуально.
Каким пациентам может быть рекомендована оценка микросателлитной нестабильности и назначение иммунных препаратов?
Пациенты, которые имеют любой метастатический рак и уже получили стандартное лечение, не оказавшееся эффективным, являются кандидатами для оценки микросателлитной нестабильности, и в положительном случае – кандидатами для назначения ингибиторов контрольных точек.
Большое значение имеет микросателлитная нестабильность при колоректальном раке. Для этой опухоли необходимо определять микросателлитную нестабильность до какого-либо лекарственного лечения.
Тимофеев Илья Валерьевич, директор Института онкологии Хадасса Москва, член Правления RUSSCO: «Тестирование микросателлитной нестабильности в клетках опухолей и доказанная эффективность терапии пембролизумабом привели к появлению нового направления в современной онкологии, так называемой tumor-agnostic therapy – терапии, не привязанной к виду рака, а назначаемой в случае выявления молекулярного маркера. Пациенты, уже исчерпавшие лечебные опции, стандартные для конкретного типа опухоли, получили еще одну надежду в виде иммунотерапии при позитивном статусе MSI».
Какие преимущества имеет определение микросателлитной нестабильности в клинике Хадасса Москва?
Благодаря современным последним технологиям, ПЦР нового поколения, в клинике Хадасса Москва (Hadassah Medical Moscow) весь процесс тестирования займёт 2,5 часа в отличие от 10-15 дней в других лабораториях, что существенно сокращает время до назначения лекарственной терапии. Для тестирования требуется опухолевый материал (парафиновый блок), содержащий всего 10% опухолевых клеток.
В случае получения позитивного результата, при наличии данных инструментальных исследований, ингибитор контрольных точек может быть назначен пациенту в тот же день.
Станкевич Любовь Ивановна, кандидат медицинских наук, руководитель лабораторной службы Хадасса Москва, вице-президент Российской Ассоциации медицинской лабораторной диагностики (РАМЛД): «Произошел сдвиг парадигмы от лечения типа онкологического заболевания к лечению конкретного пациента и конкретной опухоли. Чтобы предлагаемая программа тестирования микросателлитной нестабильности и индивидуального подбора терапии для онкологических пациентов стала возможной мы стерли границы между патоморфологическими исследованиями, генетическими, инструментальными и другими методами анализа и построили эффективное взаимодействие врачей-онкологов и специалистов лабораторной медицины в едином диагностическом пространстве»
Этапы программы
Сколько стоит тестирование?
Стоимость анализа составляет – 35 000 руб. (результат в течение 3 часов с момента получения материала) или 25 000 руб. (результат на следующий день с момента получения материала).
Количество генетических маркеров влияет на результаты исследования по установлению родства
Развитие молекулярно-генетической биологии привело к созданию точных методик, позволяющих установить биологическое родство.
В основе генетического исследования лежит сравнительный анализ материального носителя наследственности – дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
При оплодотворении происходит слияние геномов яйцеклетки и сперматозоида в результате чего образуется генотип нового организма. ДНК отца и матери в равной степени составляет геном ребенка.
Гены – функциональные единицы наследственности – существуют в одной из форм – аллелей.
Аллели отличаются последовательностью расположения нуклеотидов, что передается по наследству.
Тот факт, что все клетки, сформировавшие новый организм, содержат одинаковую ДНК – наполовину матери, наполовину отца – и позволяют определять степень родства тестируемых лиц.
Для этого изучаются короткие участки ДНК – локусы, которые повторяются с определенной очередностью. Они носят название ДНК-маркеров.
Комбинация из ДНК-маркеров составляет генетический профиль человека.
Методика проведения анализа ДНК
Стандартным материалом для генетической экспертизы является защечный эпителий, полученный при помощи мазка. Кроме того, выделить ДНК можно из любого биологического материала человека: крови, слюны, волос, ногтей, спермы, мочи.
Цель исследования – нахождение совпадений каждого фрагмента (локуса) ребенка с таким же фрагментом у предполагаемого отца. Так как такие фрагменты могут встречаться и у других мужчин в популяции, для точности результатов необходимо наличие данных о частоте встречающихся аллелей.
Для установления отцовства проводится математический анализ вероятности совпадения аллелей ребенка и вероятного отца.
Официально в России принято, что при показателе вероятности выше 99,9% отцовство считается доказанным.
Оптимальный набор локусов для достоверного анализа ДНК
Стандартный анализ на установление отцовства осуществляют по 25 генетическим маркерам. При расширении панели тестируемых маркеров повышается и точность производимого анализа.
Генетические маркеры, используемые при анализе ДНК, должны обладать высокой полиморфностью, то есть иметь не 2 аллели (варианта), а значительно больше до 10 и более. На точность результатов генетической экспертизы также влияет количество тестируемых локусов и природа локуса.
Расширенный анализ 25-40 локусов проводят: ·
При установлении родства специалисты при положительном результате указывают, что родство не может быть исключено. При отрицательных результатах заключение носит более категорический характер: родство исключено.
Незначительное отклонение от 100% при определении вероятности отцовства объясняется тем, что не исключается теоретическая возможность существования в мире человека с таким же генетическим профилем, как и у тестируемого мужчины.
Локусы, аллели, генетические маркеры что это?
В этой статье мы поможем разобраться вам во всех этих терминах, знание которых поможет понять механизм ДНК тест на установление родства, в том числе установление отцовства.
Генетика человека. Главные понятия.
В каждом человеке есть уникальный набор генов, который достается нам от родителей.
При слиянии генов наших родителей внутри нас формируется совершенно уникальный и новый генетический код. Гены располагаются в хромосомах и имеют определенное место.
Так вот, благодаря научным исследованиям были определены участки, где находится конкретный ген, именно его и называют локусом или генетическим маркером.
Гены влияют на наш цвет волос, цвет глаз, цвет кожи и т.д. их многочисленные вариации называются аллелями. Нужно понимать, что ребенок получает по одной аллели каждого гена от отца и от матери.
Как правило аллели имеют противоположные свойства: темные и светлые волосы, высокий и низкий рост. Совокупность аллелей в исследуемых локусах и есть ДНК профиль человека.
Благодаря разнообразию эти аллелей в определенных участках (локусах) можно провести ДНК тест на установление родства. Т.к. ребенок получает половину генетического материала от матери и половину от отца.
Подробнее об аллелях и наследственности.
Т.к. аллели имеют противоположные свойства, один аллель, как правило, более сильный. И этот сильный аллель будет называться доминантным. Аллель, который не проявляется называется рецессивным. В целях отличия доминантных и рецессивных аллелей их обозначают разными буквами. Заглавную букву присваивают доминантному аллелю.
Как проходит тест ДНК
Получив образцы, генетическая лаборатория производит выделение ДНК из взятых мазков.
Далее проводится процедура полимеразной цепной реакции. Для этого достаточно иметь небольшой фрагмент ДНК.
После реакции ДНК-секвенатор проводит автономное тестирование и сравнение образцов. Итоговые данные вносятся сотрудником лаборатории в компьютерную программу, производится расчёт вероятности генетической связи и родства.
Программа сравнивает контрольный образец, предоставленный предполагаемым родственником, с испытуемым образцом.
Установление степени родства проводится по методу 25 STR, это минимальное количество генетических маркеров для точного определения родства.
Метод применяется в мировых лабораториях и обладает исключительно высокой достоверностью. Заключение и результаты тестирования подписываются руководителем лаборатории, заверяются печатью. Руководитель должен иметь действующий сертификат судмедэксперта.
Результат считается положительным, если вероятность совпадения выше 99,9999%.
Уникальность строения ДНК присуща каждому человеку, совпадения невозможны. Молекулы способны хранить полную информацию о наследственности. Именно за счёт этого в современной медицине достигается высокая достоверность тестирования.
Не обнаружено аллельных вариаций исследуемых локусов что значит
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России, Москва
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, Москва, Россия, 125284
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России, Москва
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России, Москва
Межпопуляционные различия полиморфизма нуклеотидной последовательности в аллелях STR-локусов хромосомной ДНК человека
Журнал: Судебно-медицинская экспертиза. 2016;59(5): 28-35
Земскова Е. Ю., Тимошенко Т. В., Леонов С. Н., Иванов П. Л. Межпопуляционные различия полиморфизма нуклеотидной последовательности в аллелях STR-локусов хромосомной ДНК человека. Судебно-медицинская экспертиза. 2016;59(5):28-35.
Zemskova E Iu, Timoshenko T V, Leonov S N, Ivanov P L. The interpopulation differences between nucleotide sequence polymorphisms in alleles of the STR-loci of human chromosomal DNA. Sudebno-Meditsinskaya Ekspertisa. 2016;59(5):28-35.
https://doi.org/10.17116/sudmed201659528-35
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России, Москва
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России, Москва
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, Москва, Россия, 125284
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России, Москва
ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России, Москва
Одним из перспективных подходов к решению этой задачи представляется внедрение новых, более информативных аналитических методов в уже используемые «традиционные» технологические схемы. Так, например, для анализа широко распространенных молекулярно-генетических маркеров ПДАФ-типа (локусы коротких тандемных повторов хромосомной ДНК или STR-маркеров) в принципе могут быть применены альтернативные методики генотипирования, которые наряду с полиморфизмом длины позволяют детектировать еще и полиморфизм нуклеотидной последовательности ДНК-маркеров, поскольку именно в этом видится ресурс для увеличения дискриминирующего потенциала STR-маркеров. За последние несколько лет в этом направлении были развернуты целевые исследования [1].
Эти исследования показали, что полиморфизм нуклеотидной последовательности ДНК действительно можно рассматривать как потенциально значимый источник увеличения дискриминирующего потенциала STR-маркеров. Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности ДНК для генотипирования маркеров ПДАФ-типа хромосомной ДНК способен обеспечить заметное повышение эффективности их использования в качестве индивидуализирующих маркеров при выполнении молекулярно-генетических экспертиз [5].
В развитии этого направления отдельный интерес представляет изучение феномена полиморфизма нуклеотидной последовательности в аллелях STR-локусов хромосомной ДНК человека в популяционном аспекте. Тема популяционно-специфических признаков ДНК весьма актуальна. В настоящее время в мире активно ведется поиск молекулярно-генетических маркеров, которые были бы способны выступать в качестве эффективного инструмента дифференцирования популяционной принадлежности исследуемых объектов 6.
В работе предпринята попытка оценить в первом приближении межпопуляционные различия на уровне присутствия или отсутствия в исследуемых STR-маркерах точковых нуклеотидных замен (SNP).
Материал и методы
Методической основой работы является комплексный анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) и полиморфизма последовательности амплифицированных фрагментов (ППАФ) ДНК с помощью масс-спектрометрической аналитической платформы PLEX-ID («Abbott Molecular», США) 12. Принцип действия, особенности и опыт использования этой передовой технологии описаны ранее [2-4, 11].
Использовали следующий материал:
— биологические образцы от 87 этнических чеченцев;
— опубликованные данные 1 по 310 биологическим образцам от неродственных русскоязычных индивидуумов [5];
— опубликованные данные исследований 6 различных популяционных выборок, представленные в литературных источниках [1, 12-14].
Изучали индивидуальные образцы биологического материала (образцы периферической крови и буккального эпителия), полученные в рамках выполнения молекулярно-генетических идентификационных экспертных исследований. Для настоящего проекта их использовали в деперсонализированной (обезличенной) учетной форме. Препараты ДНК выделяли с помощью набора реагентов PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit («Applied Biosystems», США), согласно инструкции производителя.
Для всех полученных препаратов в качестве предварительного контрольного исследования выполнили традиционное ПДАФ-типирование полиморфных STR-локусов хромосомной ДНК [15]. Этот «одномерный» анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов аутосомных STR-локусов геномной ДНК проводили с использованием аналитической панели AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США), в состав которой входят следующие 15 генетических маркеров: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D5S818, FGA, D19S433, vWA, TPOX, D18S51.
Продукты полимеразной цепной цепной реакции (ПЦР) фракционировали электрофоретически с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3130 («Applied Biosystems», США).
Затем для всех препаратов выполили анализ в «двумерном» формате ПДАФ/ППАФ с помощью аналитической панели PLEX-ID STR CODIS loci 120 Tests («Abbott Molecular», США), в состав которой входят следующие 13 генетических маркеров: D5S818, vWA, D3S1358, D13S317, D21S11, D8S1179, D7S820, D16S539, D18S51, FGA, CSF1PO, THO1, TPOX.
Продукты ПЦР фракционировали масс-спектрометрически с использованием автоматизированного комплекса PLEX-ID Instrument («Abbott Molecular», США) [11].
Результаты и обсуждение
На I этапе проанализировали в сравнительном аспекте 7 массивов экспериментальных данных, а именно частоты встречаемости аллелей, установленных в формате ПДАФ/ППАФ с помощью применения масс-спектрометрического анализа, для 13 исследованных STR-маркеров: D5S818, vWA, D3S1358, D13S317, D21S11, D8S1179, D7S820, D16S539, D18S51, FGA, CSF1PO, THO1, TPOX в следующих популяционных выборках:
1) в 310 генотипах русскоязычных индивидуумов [5];
2) в 193 генотипах афроамериканского населения США [1, 12, 13];
3) в 213 генотипах испаноязычного населения США [1, 12, 13];
4) в 181 генотипе белого населения США [1, 12, 13];
5) в 98 генотипах этнических австрийцев [12, 14];
6) в 93 генотипах якутов [12, 14];
7) в 108 генотипах народности Khoisan (Южная Африка) [12, 14].
Данные о долевом участии SNP-содержащих аллельных форм в общем аллельном пуле для каждой из исследованных популяций представлены в табл. 1 и в графической форме на рис. 1 для четырех наиболее репрезентативных выборок.
Таблица 1. Относительное содержание SNP-вариантных аллельных форм в исследованных популяционных выборках
Рис. 1. Относительное содержание SNP-вариантных аллелей в четырех наиболее репрезентативных популяционных выборках: белые американцы (темно-серые столбики); афроамериканцы (темные столбики); испаноязычные американцы (светло-серые столбики); русские (светлые столбики).
Проведенный сравнительный анализ этих данных показал следующее. В той или иной мере феномен полиморфизма нуклеотидной последовательности аллелей STR-локусов хромосомной ДНК свойствен всем исследованным популяционным выборкам. Учитывая этническую и географическую отдаленность исследованных популяционных выборок, можно предположить, что этот феномен (наличие SNP в STR-аллелях) является достаточно распространенным явлением, по всей видимости, свойственным большинству современных этнических групп.
Для шести исследованных STR-маркеров: D13S317, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, которые обладают полиморфизмом последовательности в русскоязычной выборке [5], в других исследованных популяциях наблюдается сравнимый уровень SNP-содержащих аллельных вариантов (этот уровень определен как процентное содержание вариантных аллелей в общем пуле обнаруженных аллельных форм) (см. табл. 1).
Для некоторых исследованных популяций в ряде локусов (D16S539, vWA, D18S51, FGA, CSF1PO) наблюдаются значительные отклонения уровня полиморфизма последовательности по сравнению с другими исследованными популяционными выборками. Эти показатели выделены жирным шрифтом в табл. 1. Особый интерес представляют две популяции: белое население США и афроамериканское население США. В них для двух маркеров (D16S539 и CSF1PO) наблюдается резко отличный уровень полиморфизма последовательности по сравнению с другими исследованными популяционными выборками (в табл. 1 эти величины выделены жирным курсивом). Действительно, в исследованной выборке белого населения США, в отличие от других популяций, в локусе D16S539 отсутствуют SNP-содержащие аллели. Обратная ситуация наблюдается для локуса CSF1PO: в выборке афроамериканского населения США SNP-формы аллелей этого консервативного маркера составляют заметную долю, в то время как в других популяциях они отсутствуют. Это естественным образом наводит на мысль, что наличие или отсутствие SNP-вариантов STR-аллелей может являться особенностью (отличительный признак) той или иной определенной этнической группы.
Это предположение весьма важное с практической точки зрения и требует, возможно, большей конкретики. Здесь оно сформулировано в самой общей форме. Дело в том, что изученные нами популяционные данные из литературных источников [1, 12-14] отражают и позволяют оценить лишь общий уровень полиморфизма нуклеотидной последовательности STR-маркеров в соответствующих выборках: в этих работах для каждого исследованного локуса определено только долевое содержание SNP-вариантных аллелей в общем аллельном пуле. Эта информация недостаточна для того, чтобы сформировать детальную картину представленности конкретных SNP-вариантов STR-аллелей в различных выборках и выявить такие особенности аллельного спектра, которые могли бы быть свойственны той или иной конкретной популяционной группе.
Чтобы восполнить этот пробел, на II этапе работы провели иллюстративное исследование ограниченной моноэтнической выборки на примере 87 образцов биологического материала этнических чеченцев.
В полученных препаратах хромосомной ДНК для панели из 13 тестируемых аутосомных STR-локусов SNP-содержащие варианты электрофоретически идентичных аллелей выявилив 5 из 13 STR-маркеров (табл. 2): D13S317, D8S1179, vWA, D7S820, D16S539.
Таблица 2. Расширение аллельного спектра пяти исследованных STR-маркеров, обусловленное выявлением новых, SNP-содержащих аллельных вариантов
Диаграмма, отражающая количественный прирост числа аллелей за счет выявления новых ПДАФ/ППАФ-аллельных вариантов, представлена на рис. 2.
Рис. 2. Количественный прирост числа аллелей исследуемых STR-маркеров в чеченской популяции за счет выявления новых, SNP-содержащих аллельных вариантов (светлые столбики).
Таким образом, в данной выборке этнических чеченцев наблюдается относительно низкий уровень полиморфизма последовательности STR-аллелей. Этот факт нельзя считать показательным: такой общий низкий уровень аллельного разнообразия вполне можно объяснять ограниченным размером исследованной выборки.
Рис. 3. Увеличение дискриминирующего потенциала Pd исследуемых STR-маркеров в чеченской популяции, обусловленное выявлением новых, SNP-содержащих аллельных вариантов (темные столбики).
Рис. 4. Увеличение потенциала исключения отцовства Pe исследуемых STR-маркеров в чеченской популяции, обусловленное выявлением новых, SNP-содержащих аллельных вариантов (темные столбики).
Таблица 3. Потенциальные популяционно-специфичные аллельные варианты (выделены рамкой), обнаруженные в пяти исследованных STR-локусах. Показаны частоты встречаемости всех выявленных аллелей в русской и чеченской выборках
Рис. 5. Относительное содержание SNP-вариантных аллелей в двух сравниваемых популяционных выборках: русские (черные столбики) и чеченцы (светлые столбики).
Этот анализ позволил выявить аллельные формы, присутствующие исключительно в русской или исключительно в чеченской выборках.
Первый феномен на данном этапе не может быть прокомментирован однозначно: при условии объективно малого размера чеченской выборки естественно предположить, что аллельные варианты, встретившиеся только у русских, просто случайно не попали в исследованную выборку чеченцев.
Совсем по-другому выглядят аллели, которые присутствуют исключительно в чеченской выборке. (Такие аллели обнаружены для 5 STR-локусов: D5S818, vWA, D13S317, D16S539, D21S11) (см. табл. 3). Для них очевидна объективная и существенная разница в представленности в различных выборках. Такие признаки представляют обоснованный интерес, поскольку их можно рассматривать как потенциальные молекулярно-генетические маркеры конкретной популяционной группы.
Надо понимать, что полученные результаты в этой части имеют лишь предварительный, иллюстративный характер. Более точные выводы о возможности использования тех или иных особенностей полиморфизма нуклеотидной последовательности STR-локусов хромосомной ДНК в качестве инструмента для определения этногеографической принадлежности индивидуума могут быть сделаны только на основе анализа более репрезентативных популяционных выборок.
Работа в этом направлении ведется нами в настоящее время.